王 杰, 嚴玉萍, 楊 紅, 楊仕平

(上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院,上海 200234)

雜多藍負載的殼聚糖納米粒子抗菌性能研究

王 杰, 嚴玉萍, 楊 紅, 楊仕平

(上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院,上海 200234)

雜多藍作為多酸衍生物,由于其獨特的物理、化學性質,近年來受到人們越來越多的關注,在抗菌方面已有一些研究進展.殼聚糖廣泛的來源和低廉的價格等優(yōu)點也使其成為目前為止運用最廣的抗菌劑種類之一,但殼聚糖本身的抗菌性很低,只能對特定的細菌產生抑菌效果.主要利用殼聚糖上氨基能與帶負電荷的雜多藍通過靜電作用有效結合,采用一步法合成了基于近紅外光熱輔助抗菌的雜多藍/殼聚糖(HPB/CS)納米粒子,該納米粒子在溶液中具有較好的光熱轉換效果和抗菌效果,并且在808 nm激光輔助下有利于增強抗菌效果.

雜多藍; 殼聚糖; 納米粒子; 光熱轉換; 抗菌

0 前 言

在人們的日常生活中,經常會接觸到很多種細菌,其中比較常見的有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念球菌等.細菌的種類繁多,適應能力較強,其中有不會對人類造成危害甚至有益的細菌,如酵母菌等.但也有可以使人患病或導致人死亡的,比如霍亂、肺炎、結核病、肝炎和瘧疾等細菌,會給人們的身體健康構成嚴重的威脅.由微生物病菌引起的疾病往往很嚴重,有時是因為人們對其菌原體認識不清,造成誤診錯診,直至導致患者死亡.為了盡量減少和阻止有害微生物病菌給人們的健康和生活帶來危害,人們制備抗菌劑或抗菌材料,通過破壞細菌的新陳代謝系統(tǒng)來殺滅或抑制其生長繁殖.

隨著人們對生活質量要求不斷提高,各種抗菌藥物應運而生.然而,革蘭氏陽性球菌感染不減反增,耐甲氧西林金黃葡萄球菌檢出率上升,耐青霉素肺炎鏈球菌在許多國家與地區(qū)傳播,耐糖肽和其他多種抗生素的耐萬古霉素腸球菌也出現了.為了有效地控制細菌,尤其是耐藥菌感染,研究開發(fā)新型抗菌藥物很有必要.在眾多的抗菌材料研究中,雜多藍(Heteropoly Blue,HPB)也是其中研究熱點之一.雜多藍是雜多酸及其鹽還原后得到的混合價態(tài)配合物,結構的畸變與特殊的性質使其具有獨特的性能,具有比母體酸(或鹽)更優(yōu)異的抗堿解能力,對氧化還原、熱和酸堿有更好的穩(wěn)定性,在抗病毒、抗癌和抗菌方面都有良好的效果.大量新型的雜多藍不斷被報道出來,比較有代表性的有釩帽雜多藍[1-4],經典的 Keggin 型結構雜多藍[5-8]和一些其他結構新穎的雜多藍[9-13].其中,Keggin結構鎢系雜多化合物毒性較低且具有抗艾滋病毒(HIV-l)活性[14],在抗菌研究中逐漸顯示出重要的應用前景.本文作者所選用的雜多藍就是Keiggn型雜多藍[(CH3)4N]5[α-PMo2W10O40].

納米材料由于具有小尺寸效應、介電限域效應、量子隧道效應、表面效應等而被廣泛應用于生物熒光標記、靶向藥物載體、生物探針、催化劑、抗菌和生物傳感等方面[15-19].殼聚糖是目前為止運用較廣的抗菌劑種類之一,然而其本身的抗菌性很低,只能對特定的細菌產生抑菌效果.利用殼聚糖表面豐富的氨基和雜多藍陰離子的強靜電吸引作用,一步制備得到雜多藍/殼聚糖(HPB/CS)納米粒子.所制備的納米粒子水溶性良好,溶液水平具有較好的光熱轉換效果,并且具有良好的抗菌性能,更重要的是,設計合成的HPB/CS納米材料的抗菌機理與傳統(tǒng)的抗菌材料有所不同,不僅通過破壞細菌細胞膜而達到抗菌目的,還可以通過近紅外光熱輔助破壞細胞,達到增強抗菌的效果.

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

殼聚糖(50 kD)購自浙江金殼藥業(yè)有限公司,Na9PW9O34實驗室合成,二甲亞砜(DMSO)購自國藥化學集團有限公司.

納米粒徑電位分析儀(Malvern Nano-ZS90),808 nm激光器(FC-808-10W-MM),光熱成像儀(FLIR A300).

1.2 雜多藍/殼聚糖(HPB/CS)納米材料的制備

稱量50 mg殼聚糖,溶解于5.3 mL二次蒸餾水(以下簡稱二次水)中,搖勻備用.然后稱量20 mg雜多藍[(CH3)4N]5[α-PMo2W10O40]于50 mL單口燒瓶中,加入10.7 mL DMSO溶解,搖勻備用.

將上述兩種溶液混合均勻后置于60 ℃油浴中,以800 r/min的轉速攪拌反應7 h.停止反應,冷卻后將溶液倒入8 000～14 000的透析袋中透析4 h;離心,取離心轉速在4 000～19 000 r/min之間的納米粒子,先用乙醇沖洗1次,再用二次水沖洗2次,將得到的納米粒子均勻分散于水中.

1.3 納米粒子溶液光熱實驗

將制備所得的HPB/CS納米材料用二次水分別配制成質量濃度依次為0、200、500、800、1 000 μg/mL的納米粒子水溶液.分別取1 mL溶液置于四面透光的比色皿中,用808 nm (功率密度1 W/cm2)的激光照在比色皿中溶液的正中央.在光照的同時用近紅外光熱成像儀監(jiān)控比色皿中溶液的溫度變化情況,待溶液升溫達到平臺一段時間后停止光照(每個濃度依次由低到高進行測試).

材料的光熱穩(wěn)定性是一個需要考慮的重要問題.為了測試其穩(wěn)定性,取質量濃度為800 μg/mL的材料1 mL于上述比色皿中,首先測試溶液的吸收情況,然后給予上述同等條件的光照,10 min后停止光照,待溶液降溫至起始溫度后繼續(xù)光照10 min,如此往復光照-停止-光照,共9個循環(huán),用近紅外光熱成像儀和計算機系統(tǒng)記錄下來整個過程,最后再測一次溶液的吸收情況.

1.4 納米粒子氨基密度測試

取4 mL的樣品管2個,分別放入一片藥片并各加入3 mL二次水,超聲溶解后對照組加入50 μL二次水,實驗組加入50 μL樣品,搖勻后靜置2 min.以對照組為背景,測其吸收值,取340 nm處的吸光度值A1.兩個樣品管分別加入100 μL OPA試劑,避光反應15 min.以對照組為背景,測其紫外吸收,取340 nm處的吸光度值A2.用如下公式計算氨基密度:

(1)

其中c=129.74×(A2-A1);cNPs為納米粒子的質量濃度.

1.5 細菌培養(yǎng)

實驗所用的菌種為經典的革蘭氏陰性細菌代表大腸桿菌和革蘭氏陽性細菌代表金黃色葡萄球菌.將滅菌好的4瓶牛肉湯(100 mL/瓶)置于室溫冷卻,待冷卻到37 ℃左右時用移液槍分別移取菌種各100 μL于其中兩瓶牛肉湯中,并將其置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).12 h后從一代菌液中各取100 μL菌液置于另外兩個盛有牛肉湯的備用培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)12 h.培養(yǎng)結束后各取20 mL菌液于離心管中,以18 000 r/min轉速離心,并用滅菌過的二次水洗滌及離心各2遍,離心后用二次水配成與初始濃度相同的菌液以待備用.

1.6 納米粒子抗菌效果評估

將制備好的納米材料置于紫外燈下滅菌12 h,用滅菌后的二次水配成質量濃度分別為0、2.5、5.0和7.5 mg/mL的溶液備用.取配置好的納米粒子溶液5 mL于滅菌試管中,用移液槍移取上述備用菌液100 μL于納米粒子溶液中,試管放置37 ℃的恒溫水浴中振蕩,5 h后取出光照組的試管并給予808 nm激光光照1 h(每次照20 min,照完隔30 min再照2次,共1 h),光照結束后繼續(xù)培養(yǎng)5 h后,將每個試管中溶液按10倍梯度稀釋成共5個濃度,取其中兩個濃度的菌液100 μL打板(板為事先滅菌過的瓊脂板),搖勻后板倒置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)相中培養(yǎng)24 h,數菌落,計數.

2 結果與討論

2.1 HPB/CS納米粒子的制備及表征

對于納米材料來說,其尺寸和形貌一直是比較受關注的.如圖1a,b所示,HPB/CS納米粒子在水溶液中的水合直徑為163±3 nm;Zeta電位測試結果顯示HPB/CS納米粒子平均電位值為21±1 mV.氨基密度測試結果進一步表明納米粒子表面仍有豐富的氨基,計算結果顯示氨基密度為3.84×10-3mol/g.眾所周知,細胞表面蛋白質是帶負電荷的,帶正電荷的材料通過靜電相互作用吸附到細胞膜表面,然后通過內吞作用進入到細胞內進而發(fā)揮作用,如此看來制備所得HPB/CS納米粒子適合設計要求.圖1c和圖1d分別是制備所得納米粒子的SEM和TEM電鏡圖,可見納米粒子分散均勻,粒子平均直徑約50 nm.

圖1 (a)HPB/CS納米粒子水合直徑分布(DLS)圖;(b)HPB/CS納米粒子在水溶液中的Zeta電位分布圖;(c)HPB/CS納米粒子的SEM圖;(d)HPB/CS納米粒子的TEM圖

圖2 (a)HPB和HPB/CS納米粒子的吸收曲線圖;(b)不同濃度HPB/CS納米粒子在溶液的光熱(808 nm;1 W/cm2)升溫曲線;(c)HPB/CS納米粒子在近紅外光照前后的吸收曲線;(d)HPB/CS納米粒子光熱循環(huán)曲線(1 mg/mL)

2.2 HPB/CS納米粒子抗菌效果評估

考慮到HPB/CS納米粒子具有較好的光熱性能,并且已有的報道也表明HPB具有抗菌效果[20],探討了HPB/CS納米粒子在光熱輔助下的抗菌效果.根據對未知抗菌材料抗菌效果評估經驗,實驗選取材料質量濃度以7.5 mg/mL為界限.如圖3a中,隨著HPB/CS納米粒子濃度的增加,其對實驗細菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)的抑制率增大;當HPB/CS納米粒子濃度達到7.5 mg/mL時,對大腸桿菌抑制率達到83.1%,對金黃葡萄球菌的抑菌率為76.1%.同時實驗表明,激光光照組的抑制率比不給激光光照組的要高:當材料質量濃度為7.5 mg/mL時,其對大腸桿菌抑制率達到99%,對金黃葡萄球菌的抑菌率為99.9%.說明合成所得HPB/CS納米粒子具有很好的殺菌效果,并且在近紅外激光的輔助下其抗菌效果更為明顯.眾所周知,納米材料表面帶正電荷有利于材料通過靜電相互作用吸附到細胞膜,然后通過細胞內吞作用進入到細胞里面,通過與細胞內部發(fā)生物理或化學作用影響細胞的正常生理活動從而達到殺死細胞的目的.另外本研究所涉及的納米材料具有較好的近紅外光熱效果,當材料進入到細胞內部以后,當給予組織滲透性較好的近紅外激光(808 nm)以后,材料將來自激光的光能轉化為熱能,使細胞內部溫度升高從而使細菌的細胞消融,如此,在材料本身所具有的抗菌性能基礎上達到輔助滅菌的效果.

圖3 (a)不同濃度HPB/CS納米粒子的在不同條件下的抗菌效果圖;(b)對應(a)的抗菌效果實圖

3 結 論

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(責任編輯：郁 慧,包震宇)

Study on antibacterial properties of chitosan nanoparticles loaded with miscellaneous blue

WANG Jie, YAN Yuping, YANG Hong, YANG Shiping

(College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

As a multi-acid derivative,heteropoly blue has drawn more attention recently owing to its unique physical and chemical properties and has been used in anti-bacterial field.As is well-known,chitosan is widely-used as an antimicrobial agent owing to its high biodegradability,nontoxicity,antimicrobial property,and low price.However,the antibacterial activity of chitosan itself is very low,which needs to be improved.In this article,we synthesized heteropoly blue/chitosan (HPB/CS) nanoparticles utilizing the effective integration of the chitosan amino and negatively charged heteropoly blue by electrostatic interactions.The as-prepared HPB/CS NPs displayed good photothermal conversion ability and antibacterial effect inaqueoussolution.Also,it was found that HPB/CS NPs under 808 nm laser displayed better antibacterial effect than HPB/CS NPs without the laser.

heteropoly blue; chitosan;nanoparticles; photothermal conversion; antibacterial

2016-09-22

國家自然科學基金項目(21371122)

楊 紅,中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號,上海師范大學生命與環(huán)境科學學院,郵編:200234,E-mail:yanghong@shnu.edu.cn

O 611.66

A

1000-5137(2016)06-0712-07