周延玲, 陳 偲, 周亞蕾, 楊曉彤, 王 豐, 楊海峰

(上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院,上海 200234)

聚多巴胺/銀復合納米粒子的制備及其在細胞熒光/表面增強拉曼雙成像中的應用

周延玲, 陳 偲, 周亞蕾, 楊曉彤, 王 豐, 楊海峰

(上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院,上海 200234)

提出了一種具有熒光/表面增強拉曼光散射(SERS)雙成像能力的復合納米粒子的簡便制備方法.在銀納米粒子表面修飾上4-巰基吡啶,再在其表面包裹聚多巴胺膜并吸附羅丹明6G.選擇合適的激發(fā)波長,獲得了良好的細胞的熒光和SERS圖像,研究了腫瘤細胞的熒光/SERS雙成像與藥物釋放.這種具有熒光/SERS雙成像能力的復合納米粒子有望在生物體成像和藥物控釋等領(lǐng)域獲得應用.

熒光成像; 表面增強拉曼散射; 雙光學納米粒子; 細胞成像

0 引 言

功能性納米粒子目前已廣泛應用于生物傳感、藥物傳運、疾病診斷等領(lǐng)域[1-3].利用具有光學活性的納米粒子可以更直觀地監(jiān)測納米粒子與生物體相互作用的過程并進行生物成像.熒光成像技術(shù)以其穿透力強、靈敏度高、重復性好、所得信息豐富等特點,在生物醫(yī)學領(lǐng)域得到了廣泛的應用[4-5].例如,應用熒光成像技術(shù)可以觀察細胞內(nèi)小室和轉(zhuǎn)運通路,可以用來分析藥物及其他試劑在細胞內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)運情況.此外,細胞成像還可以提供藥物在體內(nèi)和體外復雜的生物環(huán)境中轉(zhuǎn)運的動力學信息[6-7].盡管熒光成像技術(shù)已非常成熟,但其仍然存在一些局限性,如熒光信號易被漂白、熒光發(fā)射譜較寬、生物體內(nèi)自發(fā)熒光干擾等.

除了熒光成像技術(shù),近年來新興的表面增強拉曼散射(SERS)成像技術(shù)是另一種有力的生物分析手段[8].產(chǎn)生SERS效應的前提是具有SERS能力的基底材料,即納米尺度粗糙的金屬表面.因為SERS效應只產(chǎn)生在納米尺度粗糙的金屬表面附近,所以SERS成像具有鮮明的局域特性,能很好地抑制背景信號的干擾.常見的SERS基底為膠體金屬納米顆粒,主要由金或銀元素組成,包括球形[9]、棒形[10]等金屬納米粒子.另外,表面增強拉曼光譜具有超高靈敏度、獨特的指紋光譜信息以及無損數(shù)據(jù)采集的特點,因此在環(huán)境監(jiān)測、化學分析以及生物研究中越來越受到人們的關(guān)注.基于SERS的成像分析方法具有頻帶窄、水溶液背景弱、穩(wěn)定性好、高特異性等優(yōu)勢,已成為生物成像領(lǐng)域的優(yōu)良選擇[1-2],利用所獲得的成像信息還可以進一步對成像區(qū)域內(nèi)化學物質(zhì)成分、分布及變化進行整體統(tǒng)計和描述.但與熒光成像技術(shù)相比,SERS成像技術(shù)還存在著SERS信號相對較弱、信號采集時間相對較長的缺點.

將熒光與SERS信號整合到同一納米粒子上,使該粒子同時具有熒光成像和SERS成像能力,便可首先用熒光進行信號快速定位和成像,再用SERS技術(shù)進行多目標跟蹤和定量研究,從而同時解決這兩種成像技術(shù)各自存在的問題[11-12].周軍等[13]在上轉(zhuǎn)換材料表面生長金納米粒子并負載上對巰基苯甲酸,研究了該粒子的熒光/SERS信號.崔一平等[14-15]先在金/銀納米粒子表面修飾巰基苯甲酸作為SERS源,并包覆一層負載阿霉素的介孔SiO2材料,研究了復合粒子的熒光/SERS成像能力.Lee等[16]將同時有熒光和SERS成像能力的石墨烯量子點和磁性納米粒子通過抗體/抗原聯(lián)接,形成了三明治結(jié)構(gòu)復合粒子,用于基于熒光/SERS成像的免疫研究.但目前多數(shù)具有雙成像能力的納米粒子制備過程較為復雜、拉曼信號分子容易泄露,這極大地影響了拉曼信號的強度,也給拉曼定量帶來了困難[14-15].Lee等[17]利用含有鄰苯二酚基和氨基的小分子多巴胺 (DA) 作為仿生貽貝黏附蛋白的前驅(qū)體,開發(fā)了新型仿生材料聚多巴胺(PDA).在室溫、弱堿性條件下,DA及其衍生物會被溶解氧氧化,自發(fā)聚合形成PDA.PDA可以黏附在幾乎所有材料的表面,形成均勻的納米薄膜.根據(jù)PDA的反應性還可以進一步對材料分子進行修飾,已有研究證實仿生 PDA 膜具有優(yōu)良的生物相容性[18-20].

本文作者提出了一種具有熒光/SERS雙成像能力的復合納米粒子的簡便制備方法.首先用銀納米粒子作為SERS增強基底,與拉曼分子作用產(chǎn)生SERS信號;之后利用DA的自聚合性和PDA的粘附性,在銀粒子表面包覆一層PDA薄膜并吸附熒光染料作為熒光信號源.通過選擇合適的激發(fā)波長,避免SERS信號和熒光信號的相互干擾,獲得了良好的細胞的熒光和SERS圖像.

1 實 驗

1.1 試 劑

實驗所用試劑包括:鹽酸多巴胺(DA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris·HCl)、 4-巰基吡啶(4-Mpy)購于阿拉丁試劑(上海)有限公司;硝酸銀(AgNO3)、檸檬酸三鈉(Na3Cit)、羅丹明6G(R6G),Hoechst33342購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;無水乙醇購于上海潤捷化學試劑公司.

所有的試劑均為分析純,且使用前未經(jīng)進一步純化.所用實驗均用超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm).24孔板配套用石英材質(zhì)的細胞爬片(直徑為14 mm,厚度為0.17 mm).

Tris-HCl 緩沖溶液的配制:配制物質(zhì)的量濃度為1×10-3mol/L的Tris 溶液,用稀 HCl溶液將溶液 pH 值調(diào)至8.5.

1.2 儀 器

實驗過程中所制備的銀納米粒子以及具有雙光學成像能力的復合納米粒子的消光光譜用紫外-可見分光光度計(UV-7504PC,上海欣茂儀器有限公司)測定;粒子形貌和微觀結(jié)構(gòu)由透射電子顯微鏡(TEM,JEM-2000EXII,日本日立儀器有限公司)測定;粒子粒徑由動態(tài)光散射儀(Zetasizer Nano ZS ZEN3600,英國馬爾文儀器有限公司)測定;粒子的熒光信號由熒光光譜儀(F-2500 HITACHI)和激光共聚焦熒光顯微鏡(SP5 Ⅱ,Leica Microsystems)測定;SERS光譜成像實驗由拉曼光譜儀(LabRAM XploRA,HORIBA)測定,激發(fā)波長為633 nm,功率為10 mW;粒子的SERS光譜圖由便攜式拉曼儀(ProTT-EZRaman-A2,Enwave USA)測定得到,該拉曼光譜儀的激發(fā)光源是由波長為785 nm 的二極管激光器組成,其最大可調(diào)功率為300 mW.緩沖液的酸度由pH計(PHS-3C,上海精密儀器有限公司)測定.

1.3 熒光/SERS雙響應復合納米粒子(Ag(Mpy)/PDA(R6G) NPs)的制備

銀溶膠的合成:參照Lee[21]的方法制備銀溶膠,稱量0.0255 g AgNO3裝入一潔凈的250 mL錐形瓶中,用150 mL去離子水溶解,加熱煮沸10 min 后緩慢加入3 mL質(zhì)量分數(shù)為1% 的檸檬酸三鈉溶液,繼續(xù)煮沸30 min.反應結(jié)束后,定容至 150 mL.

SERS響應復合納米粒子的制備:先取500 μL 4-巰基吡啶(1×10-4mol)與4.5 mL 銀溶膠混合,震蕩過夜,得到具有SERS響應的復合納米粒子(Ag(Mpy) NPs);之后再將5 mL的Ag(Mpy) NPs加入到10 mL多巴胺的Tris緩沖溶液中,超聲條件下,持續(xù)反應2 h,多次洗滌離心,便可以得到PDA修飾的SERS響應復合納米粒子,記為Ag(Mpy)/PDAxNPs.其中x為合成時多巴胺的質(zhì)量濃度(x=0.10,0.25,0.50和0.75 mg/mL)熒光/SERS雙響應復合納米粒子的制備:將4.5 mL Ag(Mpy)/PDAxNPs與500 μL熒光染料R6G (1×10-4mol) 混合,震蕩過夜后,離心洗滌數(shù)次,便可得到熒光/SERS雙響應復合納米粒子,記為Ag(Mpy)/PDAx(R6G) NPs,如圖1所示.

圖1 具有熒光/SERS雙成像能力的Ag(Mpy)/PDAx(R6G)復合納米粒子的制備.(a)細胞成像;(b)示意圖

1.4 人結(jié)腸癌(HT-29)細胞的培養(yǎng)

HT-29細胞購自中國科學院上海細胞庫.細胞培養(yǎng)液為體積分數(shù)是10%的胎牛血清及100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基.細胞培養(yǎng)條件為體積分數(shù)為5% CO2,培養(yǎng)溫度恒定在37 ℃,每3～4 d用胰酶酶解傳代.

細胞成像實驗中,將1×105mL-1的胰酶酶解后單個懸浮HT-29細胞接種于放置有細胞爬片的二十四孔板中,每孔500 mL,培養(yǎng)5 d,期間更換新鮮培養(yǎng)基一次.實驗時加入成像納米粒子懸液(體積比為:V培養(yǎng)基∶V粒子懸液=6∶1).繼續(xù)培養(yǎng)5 h后,棄掉孔板中的培養(yǎng)液,用1×PBS緩沖液輕輕沖洗爬片上的HT-29細胞2次;再用Hoechst33342溶液(5 μg/mL)進行細胞核染色15 min,用1×PBS緩沖液輕輕洗滌爬片上的HT-29細胞3次;再用質(zhì)量分數(shù)為2%的多聚甲醛溶液固定,最后將細胞爬片取出放置于載玻片上進行激光共聚焦成像和SERS成像.實驗中用未加入復合納米粒子的HT-29細胞作為對照組.

活細胞代謝物還原劑3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)實驗中,將HT-29細胞(104mL-1)接種于96孔板(100 μL/孔)培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的復合納米粒子.培養(yǎng)48 h后,每孔加入50 μL稀釋5倍的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸去孔中培養(yǎng)液,每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO).用酶標儀讀取490 nm處的吸收值.實驗中用未加入復合納米粒子的HT-29細胞作為對照組.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光/SERS雙響應復合納米粒子的制備與表征

圖2 Ag NPs(a)、Ag(Mpy)/PDA0.10(R6G) NPs(b)和Ag(Mpy)/PDA0.25(R6G) NPs (c)的TEM圖

制備的雙響應復合納米粒子以Ag(Mpy) NPs為SERS信號源,PDA為粘附層,在其上吸附的R6G為熒光信號源.圖2為Ag NPs和Ag(Mpy)/PDA NPs的透射電子顯微鏡(TEM)圖,由圖2可見Ag NPs粒徑約為35～50 nm;在包覆PDA的過程中,單個的Ag納米粒子發(fā)生聚集.圖3(a)為銀溶膠的紫外-可見吸收光譜圖,由圖3可見銀溶膠的表面等離子共振峰(SPR)位于408 nm左右;包覆上PDA粘附層之后,SPR峰發(fā)生紅移且在可見光范圍內(nèi)出現(xiàn)吸收,這可能是PDA粘附層使得Ag NPs所處環(huán)境介電常數(shù)增大[22],也可能是銀納米粒子發(fā)生了聚集所導致,該解釋與圖2(b),(c)的TEM結(jié)果相對應.圖3(b)為Ag NPs及Ag(Mpy)/PDAx(R6G)復合納米粒子粒徑的動態(tài)光散射圖,與上述結(jié)果一致,間接證明PDA成功包覆在銀粒子表面;且隨著DA濃度的增加,形成的復合納米粒子的聚集程度逐漸增大.

圖3 Ag NPs(1)和制備的Ag(Mpy)/PDAx(R6G)復合納米粒子(2～5分別對應x=0.10,0.25,0.50 及0.75 mg/mL)的(a)UV-vis譜圖及(b)粒子粒徑

2.2 復合納米粒子的SERS及熒光特性

Ag(Mpy) NPs的SERS光譜如圖4所示,在1 010、1 096、1 609、1 579、1 062 cm-1等處觀察到了4-Mpy的典型SERS峰,證明了4-Mpy在Ag NPs上成功修飾.復合納米粒子的SERS光譜與Ag(Mpy)粒子的SERS光譜相比較,其強度降低,間接說明PDA粘附層包覆成功.當DA濃度較低時復合納米粒子的SERS信號較弱,這可能是由于PDA是一種類黑色素物質(zhì)[23],具有吸光作用,阻礙了光的散射效應.而隨著DA濃度的增加,復合納米粒子的SERS信號先逐漸增強后逐漸減弱,這可能是由于復合納米粒子聚集程度逐漸增大,產(chǎn)生了更多的hot spot使SERS信號又有所增強;但隨著聚集程度的進一步增加,內(nèi)層的SERS信號被更多的PDA所吸收.圖5是復合納米粒子的熒光光譜圖,可見PDA能成功吸附熒光染料,并且一定程度上阻礙了R6G與Ag NPs間的能量轉(zhuǎn)移,避免了R6G熒光信號的完全淬滅.但是隨著PDA粘附層厚度的增加,雙模式納米粒子的熒光信號卻逐漸降低,這同樣是由于PDA這種類黑色素物質(zhì)具有吸光作用,導致R6G的信號強度隨PDA量的增加而減弱.通過選擇不同的激發(fā)波長,該復合納米粒子能分別產(chǎn)生較強的SERS及熒光信號,且不產(chǎn)生相互干擾.綜合考慮復合納米粒子的SERS及熒光信號,本研究中選取DA質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時制得復合納米粒子進行下面的細胞實驗.

圖4 4-Mpy在Ag NPs和Ag(Mpy)/PDAx(R6G) NPs

圖5 Ag(Mpy)/PDAx(R6G)的熒光光譜圖 (激發(fā)光波長:514 nm)

2.3 復合納米粒子在細胞成像與藥物釋放中的應用

為檢驗復合納米粒子的細胞成像能力,將該粒子與HT-29細胞共培養(yǎng)5 h后首先進行熒光成像.實驗中激發(fā)光波長為514 nm,濾過波長范圍是555～625 nm,獲得了HT-29細胞的熒光圖像,如圖6(b)所示,該圖像明確表明R6G主要分布在細胞質(zhì)中;未與粒子共培育的HT-29細胞中的細胞質(zhì)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)熒光信號,如圖6(f)所示,排除了圖6(b)中熒光為細胞自發(fā)熒光的可能.接著用波長為633 nm,功率為10 mW的激光,選取4-Mpy在1 010～1 096 cm-1處的SERS信號進行SERS成像,如圖7所示.由圖7可見SERS信號主要分布在靠近細胞膜的局部細胞質(zhì)區(qū)域,且該信號與R6G的熒光信號不重合.這可能是因為SERS信號仍然來源于聚有Ag NPs的復合納米粒子中,而R6G卻從復合納米粒子中脫附并在細胞質(zhì)中擴散.這一假設被隨后的復合粒子中R6G的釋放曲線所證實(圖8).該實驗進一步表明R6G在接近溶酶體環(huán)境的pH下更容易釋放,表明該復合納米粒子還可作為pH敏感的藥物載體材料.上述實驗證明提出的復合納米粒子可以實現(xiàn)活細胞的熒光及SERS成像,并且可以應用于藥物控制釋放.

圖6 HT-29細胞與Ag(Mpy)/PDA(R6G)復合納米粒子共培育后的激光共聚焦圖.(a)光鏡;(b)熒光,514 nm激發(fā);(c)熒光,405 nm激發(fā);(d)疊加圖,粒子質(zhì)量濃度為5 μg/mL;(e～h)未加入粒子的對照組

圖7 HT-29細胞與Ag(Mpy)/PDA(R6G)復合納米粒子共培育后的SERS圖.(a)光鏡;(b)SERS;(c)疊加圖(粒子質(zhì)量濃度為5 μg/mL)

圖8 Ag(Mpy)/PDA(R6G)復合納米粒子中的R6G在不同pH的PBS緩沖液中的釋放曲線

對于用作活細胞成像的復合粒子來說,研究其生物相容性很有必要.實驗中采用MTT法檢驗復合納米粒子的毒性.圖9表明復合納米粒子在質(zhì)量濃度較低時(<5 μg/mL)具有較好的生物相容性,可以用于活細胞成像.

圖9 Ag(Mpy)/PDA(R6G)復合納米粒子濃度對細胞活性影響的MTT實驗結(jié)果(**P<0.01;*P<0.05)

3 結(jié) 論

利用簡單便捷方法設計了一種兼具熒光及SERS響應的復合納米粒子.該粒子以拉曼分子標記的銀納米粒子為基底產(chǎn)生SERS信號,利用DA的自聚性在其表面包裹上PDA層并吸附有機染料產(chǎn)生熒光信號.將其用于細胞成像中,通過選擇合適的激發(fā)波長便可分別獲得良好的熒光及SERS信號進行熒光/SERS雙成像.利用該復合納米粒子還可以進行藥物控制釋放.根據(jù)聚多巴胺的粘附性,還原性,螯合性等可以進一步對復合納米粒子進行靶向性修飾.這種復合納米粒子在腫瘤靶向,疾病診斷及藥物控釋等領(lǐng)域具有潛在的應用前景.

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(責任編輯：顧浩然,郁 慧)

Preparation of polydopamine/silver composite nanoparticles for cell fluorescence/SERS dual-mode imaging

ZHOU Yanling, CHEN Si,ZHOU Yalei, YANG Xiaotong, WANG Feng, YANG Haifeng

(College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

A simple method for preparation of a dual mode composite nanoparticles,which combine fluorescence and surface-enhanced Raman scattering (SERS) imaging capability,is proposed in this paper.4-mercaptopyridine coated silver nanopaticles (AgNPs) were used to generate SERS signal,a thin layer of polydopamine was then coated on AgNPs to adsorb fluorescent rhodamine 6G to generate fluorescence signal.The composite nanoparticles that we gained show good image and drug release capability for cancer cell when excited by lasers with proper wavelength,which provide good prospect in application for organism image and drug controlled delivery.

fluorescence imaging; surface-enhanced Raman scattering; dual-mode imaging; composite nanoparticle

2016-09-22

國家自然科學基金面上項目(21475088);上海市科學技術(shù)委員會基金項目(14ZR1430200)

王 豐,中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號,上海師范大學生命與環(huán)境科學學院,郵編:200234,E-mail:wangfeng@shnu.edu.cn;楊曉彤,中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號,上海師范大學生命與環(huán)境科學學院,郵編:200234,E-mail:xtyang@shnu.edu.cn

Q 334

A

1000-5137(2016)06-0686-07