徐亞文，李健健，董興齊

HIV-1基因變異與耐藥之間的關系研究現況

徐亞文，李健健，董興齊

HIV-1以其高突變率、高重組率和高復制率的生物學特性，使得患者體內的病毒成為復雜的準種，給艾滋病的診斷、治療和疫苗的研制帶來眾多難題。高效抗逆轉錄病毒聯合療法的使用降低了艾滋病患者的病死率，然而在高速復制、高度遺傳變異和藥物選擇壓力的作用下，日益嚴重的耐藥問題削弱了其抑制病毒復制的作用，降低了抗病毒治療的效果。本文綜述了HIV-1常見的基因變異特點與耐藥之間關系的研究進展，以期對臨床制訂抗HIV-1藥物方案、發(fā)展新的抗HIV-1策略帶來指導意義。

HIV-1；基因變異；耐藥

HIV是艾滋病的病原體。至今，全球的HIV感染者已超過6000萬。截至2015年5月底，我國報告現存活的艾滋病感染者和患者已達561 807例，死亡173 180萬例[1]。雖然，近十年艾滋病流行呈下降趨勢，特別是包括美國、加拿大和智利等國可能已經消除了HIV的母嬰傳播，但是艾滋病依舊是影響全球健康的重大公共衛(wèi)生問題之一。HIV可以分為HIV-1型和HIV-2型兩類，全球流行的主要為HIV-1型，HIV-2型流行于非洲的局部地區(qū)。HIV-1型也是我國主要的流行毒株，本文就HIV-1基因變異的特點及其與耐藥之間的關系研究現狀綜述如下。

1 HIV-1基因的分子特性及其高度變異的生物學特性

1.1 HIV-1基因的分子特性 HIV-1屬于RNA逆轉錄病毒科中的慢性病毒亞科，其成熟的病毒粒子含2個基因組，每個基因組全長約9.8 kb，包括3個結構基因、6個調節(jié)基因和兩側長末端重復序列（long terminal repeat, LTR）。HIV-1的基因排列為LTR-gag-pol-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-LTR，其中vif、vpr、tat、rev、vpu、nef為調節(jié)基因，pol基因編碼病毒復制所需要的蛋白酶（p31、p51、p66），gag和env基因分別編碼病毒的核心蛋白（p17、p24、p55）和病毒包膜蛋白（gp41、gp120、gp160）[2-3]。HIV-1基因組具有高度的變異性，其變異包括核苷酸的替換（轉換和顛換）、缺失、插入和重組等，且變異具有不均一性。

1.2 HIV-1高度變異的生物學特性 HIV-1是具有高突變率、高重組率和高復制率的逆轉錄病毒。逆轉錄病毒的共同特征是病毒RNA基因組要逆轉錄為DNA分子。HIV有2條相同的正鏈RNA在5′端通過氫鍵互相連接在一起形成二聚體，通過逆轉錄酶（reversetranscriptase, RT）逆轉錄后生成cDNA，與人體細胞基因組結合實現病毒的復制。由于HIV-1在復制過程中RT的忠實性較差，缺乏3′→5′端外切核酸的校讀功能，基因轉錄在人體免疫或抗HIV-1藥物壓力下容易產生錯亂導致基因突變。 HIV-1基因組由將近10 000個核苷酸組成，每天至少有104～105個子代HIV-1出現位點的突變，同時在DNA合成過程中，幾乎基因組的全部區(qū)域都可能出現重組。因而在HIV-1感染的各個階段，HIV-1的持續(xù)高速復制及復制過程中的高突變率和重組率使得患者體內的病毒成為復雜的準種[1,4]，給艾滋病的診斷、治療和疫苗的研制帶來眾多難題。

2 HIV-1基因變異與疾病之間的關系

2.1 HIV-1 pol基因區(qū)變異與疾病之間的關系 pol基因是HIV-1中最保守的區(qū)域，編碼病毒的蛋白酶（protease, PR）、RT及整合酶（integrase, IN），是目前抗HIV治療的主要靶點。當強大的藥物壓力使毒株的pol基因發(fā)生突變時，大量耐藥株出現。臨床試驗表明由于突變，大約30％的HIV-1感染者不能有效激活抗逆轉錄藥物的活性[5]?；虻亩鄻有阅軌蛴绊懲N抗病毒藥物交叉耐藥的程度，導致病毒學的治療失敗，進而決定臨床治療效果、疾病進展及免疫學效應。研究表明：運用一線藥物治療失敗的患者，調整使用相應類別二線藥物時更有可能產生交叉耐藥[6]，提示一旦出現耐藥問題，調整用藥方案后應更加嚴密觀察藥物的有效性，及時發(fā)現交叉耐藥的發(fā)生，以減緩患者疾病進程，降低病死率。另外，在抗病毒療程方面，抗病毒治療早期基因突變最頻繁，故應注意在治療早期對患者進行服藥依從性教育及耐藥監(jiān)測[7]。

目前，已經確定的與艾滋病抗病毒藥物耐藥有關的HIV基因突變有200多個。其中RT區(qū)中與核苷類反轉錄酶抑制劑（nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors, NRTIs）耐藥相關的突變包含核苷類似物的耐藥相關突變、胸苷相關突變、非核苷類似物的耐藥相關突變、多核苷耐藥性突變和附屬突變共5類50多個；與非核苷類反轉錄酶抑制劑（non-nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors, NNRTIs）耐藥相關的突變包含主要的原發(fā)突變、主要的繼發(fā)突變、非多態(tài)性次要突變和多態(tài)性附屬突變共4類40多個。PR區(qū)中與PR抑制劑有關的突變包含主要突變、附屬突變、PR裂開部位突變共3類60多個；與IN抑制劑耐藥相關的IN基因突變共30多個[6,8-9]。主要突變位點與藥物治療的關系詳見表1。

表1 主要耐藥基因相關突變Table 1 The correlating mutations of main resistance genes

小部分HIV-1感染者在接受抗病毒治療以后，在機體免疫壓力和藥物壓力的作用下，可出現表中的突變點，導致該種類藥物臨床治療失敗。而大部分患者在接受治療以后，其耐藥基因卻沒有發(fā)生改變，這與患者的依從性以及毒株特點存在很大關系。在耐藥基因檢測應用于臨床的實際操作中，很多位點突變要結合實驗操作本身，有的突變并不是本身體內病毒發(fā)生的突變，而是在體外實驗過程中的誤差導致的錯誤突變，結果造成最終的耐藥情況誤差，以致于臨床用藥方案使用錯誤。因此，雖然我們已經將HIV-1耐藥基因型檢測應用于臨床疾病，但是在實際操作過程中，還需要根據該患者的其他表征結合基因型耐藥結果來判斷是否應當更換藥物，基因型畢竟不是表型，基因變異和表型變異之間還是存在一定差異，要靈活應用耐藥基因型檢測。

2.2 HIV-1 gag區(qū)變異與疾病之間的關系 gag基因編碼蛋白是構成病毒顆粒的主要成分，在病毒的組裝、出芽、成熟以及保持病毒的傳染性和病毒結構的完整性中發(fā)揮重要的作用，在成熟HIV病毒顆粒的包裝和病毒顆粒從細胞膜上的釋放等環(huán)節(jié)中也非常重要。Gag蛋白上存在大量的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）表位，在免疫選擇壓力作用下gag的基因序列不斷發(fā)生變異，這種變異在一定程度上反映HIV-1逃避機體免疫壓力的能力及其適應度的變化[10]。近年來的一些研究分析了我國HIV-1毒株gag基因區(qū)的變異特征，但這些研究主要通過分析所獲得的序列與早期共享序列在已知表位中的分布情況或根據基因內不同片段的遺傳變異狀況來研究gag基因的變異，而沒有全面分析Gag蛋白中不同氨基酸位點的變異特征。有研究發(fā)現在Gag蛋白全長氨基酸序列中存在10個多態(tài)性增加的氨基酸位點。研究表明， 我國人群中主要的HLA-I類等位基因為HLA-A02、HLA-A11和HLA-A24；HLA-B13、HLA-B15和HLA-B40；HLA-Cw01、HLA-Cw03、HLA-Cw07和HLA-Cw06[11]。通過對Los Alamos HIV免疫數據庫搜索已鑒定的CTL表位，發(fā)現其中有8個位點在我國人群主要HLA呈遞的CTL表位內，這很可能是在CTL的正向選擇壓力作用下，病毒為逃避宿主體內的免疫壓力而發(fā)生有利于病毒進化的突變。剩余第114和第376位點迄今尚無相應的CTL表位報道。因此，這2個位點是否存在仍未發(fā)現的新CTL表位有待通過免疫學實驗證實。另外，該區(qū)段被廣泛用于HIV-1分子流行病學和HIV-1疫苗的研究中[12]。Gag蛋白第153～172位氨基酸的位置為主要同源區(qū)，該區(qū)段對病毒樣顆粒的形成至關重要，此區(qū)段的氨基酸變異將影響HIV-1的復制[13]。研究表明，HLA-B13在HIV-1感染早期可抑制病毒復制，控制病毒血癥，延遲HIV-1感染后的進展，其部分作用機制是HLA-B13相關抗原表位逃逸突變如：gag-K436R、gag-I147L通過降低gag的適應度及減弱nef的免疫規(guī)避功能兩種方法以降低HIV-1的產生能力[14]。

2.3 HIV-1 env區(qū)變異與疾病之間的關系 HIV-1env基因所編碼的前體分子gp160經蛋白酶剪切加工后，成為成熟的外膜蛋白gp120和跨膜蛋白gp41，介導病毒入侵靶細胞。其中gp120是HIV-1基因組中變異率最高的片段，具有5個可變區(qū)（V1～V5）和5個恒定區(qū)（C1～C5），主要參與HIV-1對靶細胞的吸附及病毒從宿主細胞出芽釋放的生物學過程。研究顯示gp120的變異主要存在于V1～V5區(qū)，其中V3區(qū)氨基酸的改變可影響病毒與細胞的親和性及gp120的抗原性，并與中和抗體的產生有關[15-16]。若V3環(huán)11和25位同時被精氨酸（R）和谷氨酰胺（Q）所替代，HIV-1將以CXCR4作為輔助受體進入細胞，呈T細胞嗜性，體內主要是X4單嗜性病毒；若未被同時取代，則以CCR5作為輔助受體進入細胞，呈巨噬細胞嗜性，體內主要是R5單嗜性毒株。當HIV-1為T細胞嗜性時，相對巨噬細胞嗜性會加快艾滋病病程發(fā)展，X4毒株的出現伴隨感染由無癥狀轉變?yōu)橛邪Y狀，標志著進展為艾滋病癥狀期[17]。HIV-1 gp41分為3個結構功能區(qū)域：膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內區(qū)。膜內區(qū)突變、缺失不但可能損害病毒的復制、感染和致細胞病變能力，而且可以影響gp160的加工及env的裝配和穩(wěn)定性，減弱env的細胞表面內化、病毒顆粒脫殼及與基質蛋白的相互作用[18]。另外，兩性霉素B甲酯通過抑制病毒的進入及病毒顆粒的產生等方式減緩HIV-1復制，但是gp41膜內區(qū)發(fā)生突變后可以產生新的蛋白酶分裂位點，導致HIV-1對兩性霉素B甲酯產生抗性[19]。

2.4 HIV-1其他調節(jié)基因變異與疾病之間的關系 作為HIV-1的調節(jié)蛋白之一，Vif以細胞依賴方式在新生病毒的組裝、釋放或者成熟階段增加病毒自身的感染性。有研究顯示Vif V7A及F39V取代可能分別與延緩和加速疾病進展有關，是獨立于APOBEC3G表達水平之外影響疾病進程的病毒學因素，但尚須深入研究證實[20]。

tat通過轉錄反應因子與部分細胞因子作用形成蛋白-RNA復合物，活化轉錄啟動因子，加強RNA多聚酶Ⅱ的活性，從而增強病毒的轉錄能力。tat的高表達促進病毒的復制，相反tat基因缺失或突變則可使病毒復制不完全。Tat區(qū)多個位置的氨基酸變異可以影響病毒的復制能力，其中50位點K被R/Q取代，41位點K被A取代，28位點K被R/Q取代，22位點C被G取代等基因突變會較大程度的損害病毒的復制能力，而65位點H被D取代，58位點T被A取代都將增強病毒的復制能力[21]。

Nef可通過加強病毒顆粒侵襲力、激活CD4+T淋巴細胞及防止受感染細胞凋亡等多種途徑提高HIV的復制能力，Nef表位缺失可幫助HIV-1逃逸，影響機體針對HIV-1病毒的免疫反應[22]。故推測Nef蛋白不同位點的突變將影響HIV-1的各項生物學特性，如：病毒致病性、復制能力、免疫細胞激活、信號轉導等方面，從而干預病毒與宿主間相互作用，影響HIV感染后的疾病進程。

研究顯示，vpr基因參與反轉錄過程的保真性調節(jié)，促進整合前復合物的核運輸，影響細胞周期過程，誘導細胞凋亡，并對HIV-1長末端重復序列及宿主基因具有調節(jié)作用，參與RNA剪接。HIV-1 患者有vpr R85P、Q86G、A89G或E55A變異位點較無變異位點患者而言，CD4+T淋巴細胞計數值更低，考慮此變異可能與疾病進展迅速相關[23]。

3 總結與展望

作為我國艾滋病的重災區(qū)，云南省地處西南邊陲，毗鄰越南、老撾、緬甸三個艾滋病高發(fā)國家，艾滋病輸入性病例較多，加之云南省抗病毒治療推行時間早，大大增加了HIV-1基因變異及基因重組的幾率，故云南省涵蓋了我國幾乎所有的基因突變位點及基因型。未來，須進一步做好艾滋病跨境傳播的管理，動態(tài)監(jiān)測HIV-1基因變異特點，準確調整抗病毒治療方案以減少HIV傳播性耐藥的發(fā)生。與此同時，深入研究了解HIV-1的各個基因段變異的規(guī)律及其與宿主免疫應答的特征、產生的功能性變化，分析HIV-1變異與機體免疫系統(tǒng)及不同疾病狀態(tài)之間的關系，才能發(fā)現新型的抗病毒藥物的靶點以控制病毒的復制, 指導臨床醫(yī)生為患者做出更好的治療藥物選擇，最大程度避免耐藥發(fā)生，以降低疾病經濟負擔。

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（2016-11-08收稿 2016-12-02修回）

（責任編委 王永怡 本文編輯 趙雅琳）

Current status of relationship between gene variation and drug resistance of HIV-1

XU Ya-wen, LI Jian-jian, DONG Xing-qi*
Dali University, Dali, Yunnan 671000, China

The biological characteristics of HIV-1 such as high rate of mutation, recombination and replication make the virus become the complicated quasispecies in AIDS, which brings a lot of problems to the diagnosis, treatment even the development of the vaccine. Although the use of highly active antiretroviral therapy(HAART) has greatly reduced the mortality of AIDS, the growing problem of drug resistance has greatly weakened the role of HAART in inhibiting viral replication and the antiviral treatment effect in the result of the high-speed replication, high genetic variation and drug selection pressure. This review focuses on summarizing research progress about the features of gene variation and the relationship between the drug resistance among HIV-1, so as to guide the clinician to make anti-HIV-1 drug programs and new anti-HIV-1 strategies.

HIV-1; gene variation; drug resistance

R373.51； R962

A

1007-8134(2016)06-0350-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.06.008

云南省科技計劃項目（2016BC005）

671000，大理大學（徐亞文）；650301 昆明，云南省傳染病?？漆t(yī)院（李健健、董興齊）

董興齊，E-mail: dongxq8001@126.com

*Corresponding author, E-mail: dongxq8001@126.com