孫瑋遙，王向東，林　劍*

（1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005；2.山東大學 醫(yī)學院，山東 濟南 250100）

外源蛋白在畢赤酵母中的高效表達策略

孫瑋遙1，王向東2，林劍1*

（1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005；2.山東大學 醫(yī)學院，山東 濟南 250100）

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白表達系統(tǒng)之一，已成功表達了數(shù)百種外源蛋白。但不同外源蛋白的表達量差異較大，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白表達體系并不多，如何提高目的蛋白在該系統(tǒng)中的表達量有著重要的理論和現(xiàn)實意義。該文從發(fā)酵工藝方面對影響外源蛋白表達的各種因素做了具體闡述，主要包括培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化、發(fā)酵過程參數(shù)的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及誘導型畢赤酵母的甲醇流加機制，旨在提高外源蛋白表達量。

畢赤酵母表達系統(tǒng)；外源蛋白；發(fā)酵工藝；優(yōu)化

以脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA）重組技術(shù)為代表的基因工程的飛速發(fā)展，為分子生物學領(lǐng)域的各項研究提供了契機。蛋白質(zhì)作為基因表達的產(chǎn)物，成為了一直以來的研究熱點，從而也帶動了蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)的快速發(fā)展。畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)作為目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白表達系統(tǒng)之一，已成功表達了包括激素、疫苗、細菌毒素以及各類藥用制品在內(nèi)的數(shù)百種外源蛋白。

雖然已有數(shù)百種外源蛋白在畢赤酵母中表達成功，但不同外源蛋白的表達量卻差異巨大。HASSLACHER M等［1］報道過的用畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)胞內(nèi)羥基腈裂解酶，表達量可達22 g/L，而WEISS S等［2］用畢赤酵母表達倉鼠阮病毒蛋白質(zhì)PrPc的表達量卻不足0.1 mg/L。因此，研究不同蛋白在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的表達機制及發(fā)酵條件具有重要意義。

影響不同外源蛋白在畢赤酵母中表達的因素一方面來自于細胞水平的工程菌構(gòu)建，即通過基因操作手段提高單個細胞的蛋白分泌量；另一方面，從宏觀角度上通過優(yōu)化發(fā)酵工藝來提高外源蛋白的表達量。由于現(xiàn)階段畢赤酵母表達系統(tǒng)的分子生物學研究已比較透徹，因此，本文主要從發(fā)酵工藝方面探討了影響外源蛋白表達量的條件，主要包括培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化、發(fā)酵過程參數(shù)的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及誘導型畢赤酵母的甲醇流加機制，以提高外源蛋白的表達量，為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供指導。

1　培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化

1.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為畢赤酵母生長提供必須的氮源、碳源、生物素等營養(yǎng)物質(zhì)，對菌體的生長和外源蛋白的表達有直接影響?，F(xiàn)在畢赤酵母發(fā)酵大都采用Invitrogen公司提供的緩沖甘油培養(yǎng)基（buffered glycerol-complex medium，BMGY）/緩沖甲醇培養(yǎng)基（bufferedmethanol-complexmedium，BMMY）和最小緩沖甘油培養(yǎng)基（bufferedminimalglycerol，BMG）/最小緩沖甲醇培養(yǎng)基（buffered minimal methanol，BMM），這兩種培養(yǎng)基中含有磷酸鹽緩沖液，能使pH穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，因此適合于表達pH不能在線控制情況下的分泌型外源蛋白。發(fā)酵罐規(guī)模的培養(yǎng)基大多采用成本較低的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（basal salt medium，BSM）和FM22等培養(yǎng)基，這類培養(yǎng)基通常以菌體利用較快的甘油為碳源，添加各種無機鹽離子以及微量元素、生物素等組成的營養(yǎng)鹽，發(fā)酵過程中以流加氨水的方式調(diào)節(jié)pH同時補充氮源。但營養(yǎng)鹽和生物素需要單獨過濾除菌，增加了發(fā)酵操作的復雜性，且培養(yǎng)基中由于鹽離子濃度過高往往在滅菌后形成沉淀，影響菌體的正常生長。COS O等［3］對BSM和FM22培養(yǎng)基與D'ANJOU M C等［4］設(shè)計的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的組分差異做了分析，指出氮源添加方式的不同會對菌體生長以及蛋白表達產(chǎn)生影響。以流加氨水控制pH的方式補充氮源，易形成氮源缺乏造成蛋白酶分泌量增加，從而造成外源蛋白的減產(chǎn)。所以，BSM和FM22這類培養(yǎng)基在使用過程中需要補充一定量的氮源，如（NH4）2SO4等無機氮源。但是，氮源濃度過高也會引起菌體生長的滯后。陳明祥等［5］研究了培養(yǎng)基中（NH4）2SO4濃度對南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarcticalipase，CALB）表達量的影響，結(jié)果表明，（NH4）2SO4質(zhì)量濃度高于10 g/L時，NH4+濃度高于100mmol/L，細胞濃度及表面展示CALB酶活力下降近30%。因此，通?？刂婆囵B(yǎng)基中NH4+濃度不超過100mmol/L。

碳源是菌體生長不可或缺的結(jié)構(gòu)性底物。研究發(fā)現(xiàn)，菌體對甘油的利用效率高于葡萄糖等碳源物質(zhì)，更有利于促進細胞增殖與產(chǎn)物積累［6］。所以，現(xiàn)在多采用甘油作為發(fā)酵核心碳源。但甘油濃度過高或過低時都會影響菌體生長，且甘油對啟動子AOX有抑制作用，因此發(fā)酵過程需要嚴格控制甘油濃度。另外，甘油的成本較高，較大規(guī)模的工廠化發(fā)酵還需考慮成本問題，因此，工業(yè)上發(fā)酵生產(chǎn)附加值低的植酸酶等產(chǎn)品時，通常選用較廉價的葡萄糖作為碳源［7］。另外，有研究者嘗試將麥芽汁、麥麩類作為畢赤酵母培養(yǎng)基用以表達外源蛋白，提高了產(chǎn)出與投入比，降低了發(fā)酵成本［8］。

1.2補料流加方式的優(yōu)化

菌體生物量的積累是提高外源蛋白表達量的關(guān)鍵。當生長階段培養(yǎng)基中碳源耗盡時可以通過流加補料方式補充甘油，使菌體再次生長到達更高生物量水平。這個階段的補料碳源、補料速率、流加方式及時間等都是細胞增殖效率的影響因素。為了實現(xiàn)畢赤酵母高密度培養(yǎng)的工業(yè)化放大，不少研究者對補料方式做了深入研究［9］。常用補料方式包括3種：間歇性流加補料、恒速流加補料以及指數(shù)流加補料。間歇性流加和恒速流加方式較為普遍，且操作簡單，但往往不能很好的滿足菌體生長需要。指數(shù)流加是根據(jù)菌體生長規(guī)律而建立的補料方式，這種方式能較好的保持補料速率與菌體需求的一致性，但對菌體生長速率的把握有一定難度。研究發(fā)現(xiàn)，當以較高的速率補充甘油能達到高細胞密度，但同時易積累過量的乙醇及乙酸鹽從而造成活性蛋白的減產(chǎn)；當以較低的速率補充甘油時有利于產(chǎn)物表達量的提高，但卻延長了過渡期，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，發(fā)酵過程中應(yīng)合理把握細胞每個階段的比生長速率，以此調(diào)整甘油的流加速率，提高底物利用率，為工業(yè)化生產(chǎn)提供指導。

2　發(fā)酵過程參數(shù)控制

2.1溫度

溫度對畢赤酵母發(fā)酵過程中菌體的生長以及外源蛋白的表達都有重要影響。溫度通過影響參與微生物體內(nèi)反應(yīng)的各種酶活性，進而影響菌體的生長速率和產(chǎn)物合成速率。因此，選擇合適的發(fā)酵溫度極其重要。畢赤酵母的最適生長溫度是30℃，而誘導表達的溫度則因外源蛋白的不同存在差異，但一般都≤32℃，因為較高溫度下外源蛋白表達量顯著下降，細胞衰亡速率增加。不少研究者指出，低溫更有利于誘導外源蛋白的合成［10］。ZHOU X等［11］研究了不同誘導溫度對人源類溶菌酶LYZL6表達量的影響，發(fā)現(xiàn)將溫度從30℃降低至24℃能大幅度提高蛋白表達量。JIN H等［12］采用低溫方式發(fā)酵外源α-干擾素，結(jié)果表明，20℃時的表達量是30℃時表達產(chǎn)量的1.6倍，可達到5 g/L。不同外源蛋白表達體系的最適誘導溫度往往不同，因此，針對不同外源蛋白，選擇最適的誘導溫度能有效提高目的蛋白的表達量。

2.2pH

pH作為發(fā)酵過程中重要的化學參數(shù)，對發(fā)酵液的物理性質(zhì)、細胞膜的電荷狀態(tài)及參與細胞反應(yīng)的酶活性等有重要影響，進而影響菌體的生長及目的蛋白質(zhì)的表達。據(jù)研究報道，pH在3.0～7.0的范圍內(nèi)畢赤酵母均可以正常生長，低于2.2時細胞生長會受到抑制［13］。但考慮到菌體細胞膜的性質(zhì)，以及畢赤酵母生長過程中產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物會對后期誘導表達產(chǎn)生重要影響，因此，通常選擇控制發(fā)酵pH在4.0～6.0范圍內(nèi)。目前，在畢赤酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)過程中，一般采用通過流加氨水變調(diào)pH的方法來控制菌體的生長和目的產(chǎn)物的表達。大規(guī)模發(fā)酵使用BSM培養(yǎng)基時，細胞生長期的pH一般為5.0，因為超過該值時，培養(yǎng)基中無機鹽離子易形成沉淀，對發(fā)酵產(chǎn)生不利影響。在分泌型蛋白表達過程中，選擇合適的誘導pH能通過改善菌體內(nèi)某些酶的活性，促進對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝，從而提高目的蛋白的表達量［14］。

2.3溶氧

畢赤酵母是一種強好氧微生物，在進行發(fā)酵培養(yǎng)時，菌體的快速增長伴隨著耗氧量的增大，且菌體的生長期和產(chǎn)物表達期對氧的需求量往往不一致［15］。如果供氧不足，容易造成菌體生長受限，進而影響目的蛋白的表達。因此菌體生長期時，溶氧（dissolved oxygen，DO）一般控制在30%以上，而在誘導表達階段維持在20%以上［16］。另外，當流加補料過程中甘油濃度過高，而溶氧供應(yīng)不足時，發(fā)酵液中往往會積累甘油厭氧發(fā)酵生成的乙醇、乳酸等副產(chǎn)物，會對發(fā)酵產(chǎn)生不利影響。因此，控制發(fā)酵過程中的溶氧水平對于高效表達外源蛋白至關(guān)重要。然而，溶氧水平過高也會對菌體生長和繁殖產(chǎn)生影響［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中高濃度的氧自由基會對細胞產(chǎn)生毒害作用［18］。因此，針對不同的反應(yīng)體系，需要控制溶氧濃度在適宜的范圍內(nèi)，才能保證外源蛋白的高效表達。

3　分泌型蛋白酶的降解抑制

對于分泌型外源蛋白來說，蛋白酶的降解作用常常是造成發(fā)酵液中外源蛋白濃度低下的重要原因。蛋白酶降解不僅能引起發(fā)酵液中外源蛋白濃度的下降，還會造成生物活性的降低，同時也會增加產(chǎn)品分離純化的難度。發(fā)酵液中外源蛋白的降解主要是被培養(yǎng)基中胞外蛋白酶、細胞外膜結(jié)合蛋白酶和細胞自噬釋放的胞內(nèi)蛋白酶降解的。因此，降低畢赤酵母自身蛋白酶的分泌、抑制其酶活性是提高發(fā)酵液中外源蛋白濃度的重要方法。有研究表明，各種胞外蛋白酶的量會隨著發(fā)酵條件的改變而變化，如發(fā)酵過程中的饑餓脅迫、碳源改變、溫度和pH變化及有毒有害產(chǎn)物的形成等。所以，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，能有效控制蛋白酶分泌量。目前主要采用的方式有：（1）在保證目的蛋白穩(wěn)定性的前提下，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH、降低誘導溫度來抑制蛋白酶活性［19］。（2）在培養(yǎng)基中添加適量的蛋白酶底物如蛋白胨、酪蛋白等，以降低對目的蛋白的降解作用。（3）在培養(yǎng)基中添加乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）等酶抑制劑，抑制蛋白酶活性，從而減少目的蛋白的降解。本實驗室在研究重組人血清白蛋白表達的過程中發(fā)現(xiàn)，向發(fā)酵液中添加硫酸銨能抑制蛋白酶的活性，當保持發(fā)酵液中銨離子質(zhì)量濃度為3.0 g/L時，能有效緩解發(fā)酵液中白蛋白的降解速度，提高發(fā)酵液中白蛋白產(chǎn)量［20］。（4）將外源蛋白與另一種能夠在畢赤酵母中穩(wěn)定的蛋白伴侶融合表達，也能減少目的蛋白的降解［21］。

4　甲醇流加機制的建立

誘導型畢赤酵母表達外源蛋白的第一步即在培養(yǎng)基中添加甲醇，一方面添加的甲醇為菌體生長提供碳源；另一方面，甲醇在啟動子AOX基因編碼的醇氧化酶的催化下分解，調(diào)控表達目的蛋白。因此，在誘導期，調(diào)控甲醇誘導機制對提高外源蛋白表達量有重要影響。當甲醇濃度太低時，由于誘導劑的缺乏，蛋白表達量極低，且易被自身蛋白酶降解。而當甲醇濃度過高時，過量的甲醇對細胞有毒害作用，從而降低產(chǎn)物表達量。合理控制發(fā)酵液中甲醇濃度成為高密度發(fā)酵的關(guān)鍵問題。

4.1甲醇濃度的檢測方法

目前來看，甲醇濃度的檢測方法主要分為離線檢測和在線檢測兩種。常用的離線檢測方法主要是氣相色譜法、高效液相色譜法、酶化學法、分光光度計法以及近紅外光譜法。但這種離線檢測的滯后性容易造成發(fā)酵液中某一時刻甲醇濃度的突變，對目的產(chǎn)物的表達造成不利影響。因此，人們逐漸發(fā)展了甲醇的在線檢測技術(shù)。SURRIBAS A等［22］提出了順序注射分析法（sequentical injection analysis，SIA）在線監(jiān)測甲醇濃度。這種方式基于生物傳感器技術(shù)，每小時可連續(xù)檢測7個樣品，檢測偏差小，具有較好的應(yīng)用性。之后，國內(nèi)外又相繼報道了固定化酶—化學發(fā)光檢測法［23］、YSI-2700甲醇選擇分析儀［24］以及蒸汽傳感器［25］等方法在線監(jiān)測甲醇濃度。近年來，華東理工大學生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室對甲醇等底物的在線檢測做了深入的研究。吳勝等［26］通過使用衰減全反射技術(shù)結(jié)合傅里葉紅外光譜法，建立了甲醇濃度的預(yù)測模型，成功在5 L發(fā)酵罐中監(jiān)測甲醇的濃度變化，為提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達量提供了指導。

4.2甲醇流加策略

除了直接以檢測含量的方式控制發(fā)酵液中甲醇濃度外，還可以通過合適的策略優(yōu)化甲醇的流加方式?，F(xiàn)在畢赤酵母發(fā)酵研究中最常用的兩種方式分別是根據(jù)溶氧控制甲醇流加和維持菌體比生長速率恒定的甲醇流加方式。

4.2.1根據(jù)溶氧變化流加甲醇

微生物發(fā)酵過程中，溶氧等參數(shù)可以反映碳源的消耗情況。當碳源耗盡時，微生物的生長代謝就會停止，DO值會上升；這時如果向反應(yīng)器中重新補充碳源，微生物的生長代謝就會重新開始，氧的消耗就會增加，則發(fā)酵液中的溶氧濃度DO值就要隨著下降。因此，當甲醇作為誘導期唯一碳源時，可以根據(jù)溶氧變化調(diào)節(jié)流加速率。已有許多研究者報道了用這種方式控制甲醇的流加并取得了較高的目的蛋白表達量［27］。但這種方式存在一定的問題。當甲醇濃度過高時，菌體生長受到抑制，同樣會表現(xiàn)為DO值的上升。這時如果再加入甲醇，就會造成甲醇積累，對菌體生長和蛋白表達造成嚴重影響。而且在應(yīng)用這種調(diào)節(jié)方式的過程中，甲醇的流加是采用脈沖式的，其濃度在不斷變化，而菌體的比生長速率也在不斷地變化，因此，對研究這些變量對外源蛋白表達量的影響，建立以溶氧濃度DO值為依據(jù)的甲醇流加機制也有一定的困難［28］。

4.2.2維持恒定比生長速率的流加方式

維持恒定的比生長速率有利于獲得高生物量，將此方法應(yīng)用在畢赤酵母發(fā)酵過程中，以開放型流加方式控制甲醇的流加對于提高目的蛋白表達量起到了重要作用［29］。這種方式建立在簡單的細胞生長模型之上，不需要任何反應(yīng)器參數(shù)指導，甲醇的流加速率取決于基于質(zhì)量平衡方程理論上的恒定比生長速率。D'ANJOU M C等［30］研究了按照菌體的生長規(guī)律，在合理的模型指導下，以相應(yīng)指數(shù)形式流加甲醇和甘油的混合底物可獲得較高的目的產(chǎn)物表達量。TRINH L B等［31］同時比較了甲醇傳感器在線監(jiān)測法、溶氧參數(shù)法和恒定比生長速率的模型流加方式三種方式在表達內(nèi)皮抑制素過程中的差異。結(jié)果表明，三種流加方式的最終蛋白表達量均為133 mg/L，但是控制比生長速率為0.02 h-1的模型流加方式由于限制了甲醇的流加量，生物量明顯低于其他兩種方式，從而使得相同甲醇耗用量下，單位細胞濃度的蛋白產(chǎn)量比其他兩種方式提高了2倍。因此，這種模型流加方式不僅有效地提高了蛋白表達量，還降低了甲醇消耗量，節(jié)約了生產(chǎn)成本。針對不同的蛋白表達體系，具體的甲醇流加方式還有待進一步的實驗摸索確認，以尋求適合蛋白分泌表達的最優(yōu)條件。

5　總結(jié)與展望

畢赤酵母表達系統(tǒng)自20世紀80年代發(fā)展至今，在外源蛋白表達方面顯現(xiàn)出了獨特優(yōu)勢，因而受到越來越多的關(guān)注。但由于外源蛋白的特異性，不同蛋白在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的表達量差異顯著，極大地限制了工業(yè)化生產(chǎn)。由于現(xiàn)階段畢赤酵母表達系統(tǒng)的分子生物學研究已比較透徹，因此，在表達系統(tǒng)構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件是提高外源蛋白表達量的有效手段。在發(fā)酵過程中，發(fā)酵條件的選擇、工藝參數(shù)的確定以及誘導機制的建立都與外源蛋白的表達量有著密切關(guān)系。眾多的研究結(jié)果表明，不同外源蛋白因分子量等性質(zhì)的不同、結(jié)構(gòu)的差異等，其發(fā)酵工藝參數(shù)與蛋白表達量的關(guān)系也不同，因此，根據(jù)表達蛋白自身性質(zhì)的不同而建立相應(yīng)發(fā)酵工藝體系對于深入研究外源蛋白性質(zhì)與表達機制的關(guān)系有重要意義，也為探索新型外源蛋白在畢赤酵母中的表達提供指導。

目前，很多實驗室規(guī)模的外源蛋白的過程控制和優(yōu)化技術(shù)已經(jīng)取得了較好的成果，但放大到工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)上卻受到種種限制。因此，深入研究發(fā)酵控制策略在中試生產(chǎn)中的應(yīng)用將是未來畢赤酵母工藝優(yōu)化的重要發(fā)展方向。相信隨著研究的不斷深入，畢赤酵母表達系統(tǒng)在分子生物學、微生物學、發(fā)酵工程及生物制藥等領(lǐng)域的應(yīng)用將越來越廣泛。

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High efficiency expression strategy for heterologous protein inPichia pastoris

SUN Weiyao1，WANG Xiangdong2，LIN Jian1*
（1.College of Life Science，Yantai University，Yantai 264005，China；2.School of Medicine，Shandong University，Jinan 250100，China）

ThePichia pastorisexpression system is one of the most widely used protein expression systems.Several hundreds heterologous proteins were expressed successfully.It was successfully expressed several hundred kinds of heterologous protein，but few protein expression system can realize industrialized production.How to improve the expression quantity of target protein in the system has important theoretical and practical significance.Various factors influencing the expression of heterologous proteins in fermentation process were discussed specifically from the aspects of fermentation process，including the selection and optimization of culture medium，control of fermentation parameters，degradation inhibition of secreted protease and mechanism of methanol flow in inducibleP.pastoris，in order to improve the expression quantity of heterologous protein.

Pichia pastorisexpression system；heterologous protein；fermentation process；optimization

Q815

0254-5071（2016）09-0011-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.003

2016-06-07

國家自然科學基金（81370881）；煙臺大學研究生科技創(chuàng)新基金重點項目（YDZD1610）

孫瑋遙（1992-），女，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵。

林劍（1963-），男，副教授，本科，研究方向為微生物發(fā)酵。