施珍，周麗娜，張益前，王德選，莊捷秋

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027；2.溫州市人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州325000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

?論 著?

WNK1激酶對Maxi K通道的調(diào)節(jié)作用

施珍1，周麗娜2，張益前1，王德選3，莊捷秋3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027；2.溫州市人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州325000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

目的：研究WNK1激酶對Maxi K通道的調(diào)節(jié)作用。方法：將攜帶WNK1和Maxi K目的基因的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染在HEK-293T細(xì)胞上，分別應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色、Western blot觀察WNK1對Maxi K在細(xì)胞上分布及總蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果：免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的Maxi K在細(xì)胞上的分布明顯增多。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2的Maxi K總蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01）；與實(shí)驗(yàn)組1相比，實(shí)驗(yàn)組2的Maxi K總蛋白表達(dá)水平亦明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論：WNK1能上調(diào)Maxi K的總蛋白表達(dá)水平，且隨著WNK1 DNA劑量的增加，上調(diào)作用逐漸增強(qiáng)，顯示其上調(diào)作用具有劑量依賴性。

WNK1；Maxi K；假性醛固酮減少癥Ⅱ型；高血壓

高血壓是冠心病、腦卒中等眾多心血管疾病最大的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。高血壓的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，包括遺傳和非遺傳因素。其中一些離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體在高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸引起科研工作者的關(guān)注。WNK激酶（with no lysine kinase）是一類新發(fā)現(xiàn)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，因其家族成員在激酶功能領(lǐng)域缺乏與ATP結(jié)合的賴氨酸而得名[1]。迄今，在人類共發(fā)現(xiàn)了該家族的4個(gè)成員，即WNK1、WNK2、WNK3和WNK4。其中WNK1有2種類型，全長WNK1（full-length WNK1，L-WNK1）和腎臟特異性WNK1（kidney specific WNK1，KS-WNK1）。許多研究提示，WNK激酶構(gòu)成了一種新的信號通路，是目前高血壓研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Maxi K通道，又稱為鈣激活鉀通道，廣泛分布于心肌以外的各種不同組織中如腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)，在平滑肌上分布尤為豐富[2]，與高血壓有著不容忽視的聯(lián)系。本研究聚焦于與高血壓關(guān)系密切的2個(gè)新興分子，WNK1激酶和Maxi K通道，在人胚腎細(xì)胞（HEK-293T細(xì)胞）上研究WNK1激酶對Maxi K的調(diào)節(jié)作用，旨在探索高血壓的發(fā)病機(jī)制，為新的降壓藥的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 HEK-293T細(xì)胞株購于上海中科院；WNK1、Maxi K和Vector的質(zhì)粒DNA均由美國Emory大學(xué)醫(yī)學(xué)院腎臟科蔡暉教授實(shí)驗(yàn)室提供；單克隆小鼠抗HA抗體、單克隆小鼠抗myc抗體、單克隆小鼠抗β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購于上海鈺森公司；TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購于北京中杉公司；實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)場所由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院科研中心提供。

1.2 方法

1.2.1 HEK-293T細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HEK-293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS+1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿（規(guī)格為10 cm）中，置于細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱（37 ℃，5% CO2，飽和濕度）內(nèi)孵育。細(xì)胞分離24～36 h觀察到細(xì)胞貼壁生長豐度達(dá)到70%～80%時(shí)，為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA的最佳時(shí)機(jī)。將所需的質(zhì)粒DNA+脂質(zhì)體2000+OPTI-MEM（不含血清）混合物均勻滴入培養(yǎng)皿中，輕搖混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱內(nèi)，5 h后棄去OPTI-MEM（不含血清），加入10 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，重新放置細(xì)胞孵育箱里孵育；細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA后36～48 h，即可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫熒光法觀察WNK1激酶對Maxi K在細(xì)胞上分布的影響：在1.5 mL的尖底帶蓋離心管中加入0.3 mL OPTI-MEM和3 μL的脂質(zhì)體2000，混勻；然后在對照組中轉(zhuǎn)染pCDNA 4.0 Vector（空白質(zhì)粒）3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg，實(shí)驗(yàn)組中轉(zhuǎn)染pCDNA 4.0 his-myc WNK1 3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；振蕩混勻后在室溫下放置30 min。再將質(zhì)粒DNA+脂質(zhì)體2000+OPTI-MEM混合物均勻滴入培養(yǎng)有HEK-293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，輕搖混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱（37 ℃，5% CO2，飽和濕度）內(nèi)，5 h后棄去OPTI-MEM，加入2 mL DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，重新放置細(xì)胞孵育箱里孵育。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h后，進(jìn)行免疫熒光染色和熒光顯微鏡觀察。實(shí)驗(yàn)中使用單克隆小鼠抗HA抗體和FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG檢測Maxi K，熒光顏色呈現(xiàn)為綠色。細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需質(zhì)粒DNA見表1。

1.2.3 Western blot法觀察WNK1激酶對Maxi K總蛋白表達(dá)水平的影響：在HEK-293T細(xì)胞上，對照組轉(zhuǎn)染pCDNA 4.0 Vector 6 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；實(shí)驗(yàn)組1轉(zhuǎn)染pCDNA 4.0 his-myc L-WNK1 3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；實(shí)驗(yàn)組2轉(zhuǎn)染pCDNA 4.0 his-myc L-WNK1 6 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg。轉(zhuǎn)染2 d后，提取蛋白，進(jìn)行Western blot檢測。實(shí)驗(yàn)中使用的一抗：單克隆小鼠抗myc抗體（1∶500），單克隆小鼠抗β-Actin抗體（1∶500），單克隆兔抗HA抗體（1∶1 000）；二抗：HRP山羊抗小鼠IgG抗體（1∶5 000），HRP山羊抗兔IgG抗體（1∶5 000）。使用Supersignal顯色進(jìn)行顯影和定影來檢測WNK1、Maxi K和β-actin。細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需質(zhì)粒DNA見表2。

表1 免疫熒光法中細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需質(zhì)粒DNA（n=3）

表2 Western blot法中細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需質(zhì)粒DNA（n=3）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊則采用Dunnett T3檢驗(yàn)。非正態(tài)數(shù)據(jù)組間采用Krukal-Wallis H檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HEK-293T細(xì)胞的形態(tài) HEK-293T細(xì)胞株來源于人胚腎上皮細(xì)胞，用于本實(shí)驗(yàn)的外源基因的轉(zhuǎn)染。倒置顯微鏡下觀察HEK-293T細(xì)胞貼壁生長，呈三角形或多角形，胞漿透亮，胞核可見，有的胞膜向周圍突起成不規(guī)則形，提示細(xì)胞生長狀態(tài)良好，見圖1。

2.2 免疫熒光結(jié)果 對照組轉(zhuǎn)染pCDNA 4.0 vector（空白質(zhì)粒）3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pCDNA 4.0 his-myc L-WNK1 3 μg和pCMVHA Maxi K 1 μg。綠色熒光為Maxi K在細(xì)胞上的表達(dá)。在對照組中，Maxi K表達(dá)量不多，主要位于細(xì)胞膜表面，而在實(shí)驗(yàn)組中，Maxi K表達(dá)明顯增多，分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)，見圖2。

圖2 HEK-293T細(xì)胞免疫熒光結(jié)果（×400）

2.3 Western blot結(jié)果 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2 Maxi K總蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P ＜0.01）。而與實(shí)驗(yàn)組1相比，實(shí)驗(yàn)組2 Maxi K總蛋白表達(dá)水平亦明顯升高（P＜0.05）。由此可見，WNK1激酶對Maxi K總蛋白表達(dá)存在上調(diào)作用，且這種上調(diào)作用呈劑量依賴性，見圖3。

圖3 WNK1激酶對Maxi K總蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

假性醛固酮減少癥I I型（pseudohypoaldosteronism I I，PHA I I），又稱為Gordon綜合征，臨床上表現(xiàn)為高血壓、高鉀血癥、高氯血癥、代謝性酸中毒和正常的腎小球?yàn)V過率。Wilson等[3]發(fā)現(xiàn)位于12號染色體上的WNK1基因缺失和位于17號染色體上的WNK4基因錯(cuò)義突變可導(dǎo)致PHA I I的發(fā)生。此后，Hoorn等[4]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)WNK1基因的缺失和WNK4基因的突變導(dǎo)致下游鈉氯共轉(zhuǎn)運(yùn)子（sodium chloride cotransporter，NCC）等重吸收鈉氯離子增加所致，拮抗劑噻嗪類利尿藥可有效控制PHA I I患者的高血壓癥狀。目前研究提示，WNK激酶構(gòu)成了一種新的信號通路，它們是腎臟中多個(gè)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和通道的上游調(diào)控蛋白，在維持腎臟血壓調(diào)控及電解質(zhì)平衡中起非常重要的作用[5-6]。WNK1是WNK家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，是科研學(xué)者在從大鼠腦cDNA文庫中篩選MEK激酶家族新成員時(shí)發(fā)現(xiàn)。人WNK1基因位于12p13.3，基因全長為150 kb，主要有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，一個(gè)為L-WNK1，約12 kb，主要表達(dá)在骨骼肌和心臟組織；另一個(gè)為短轉(zhuǎn)錄本，約10 kb，主要表達(dá)在腎臟，該轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)物無蛋白激酶活性，被稱KSWNK1。本研究中的WNK1為L-WNK1。Kahle等[7]研究顯示，WNK1幾個(gè)常見的單核苷酸多態(tài)性和單倍型與普通人群動態(tài)血壓的變化相關(guān)。Newhouse等[8]研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)靠近WNK1啟動子的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與高血壓的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性，并且提示W(wǎng)NK1表達(dá)增加可能提高原發(fā)性高血壓的變異性和易感性。

新的研究發(fā)現(xiàn)鈣激活鉀通道，又可稱為Maxi K、BK通道或Slo1，為電壓門控鉀離子通道超家族中的一員，電導(dǎo)大（100～300 pS），由Slo1基因編碼。近年來，人們通過研究發(fā)現(xiàn)，許多疾病的發(fā)生均與Maxi K通道的調(diào)節(jié)異常有關(guān)。生理?xiàng)l件下，Maxi K通道持續(xù)激活并作為超極化因素以減少電壓依賴的鈣離子內(nèi)流，在維持血管平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cell，SMC）靜息膜電位上起著重要作用。Maxi K被阻斷即可引起平滑肌收縮，進(jìn)而導(dǎo)致高血壓的產(chǎn)生。在大鼠主動脈及基底動脈SMC和人動脈SMC中，當(dāng)Maxi K被其特異性抑制劑IbTx阻滯后，它們將產(chǎn)生血管收縮及對抗血管擴(kuò)張劑的擴(kuò)血管作用[9]。

目前的研究報(bào)道WNK1激酶對血壓及電解質(zhì)平衡的調(diào)控得益于它對多種離子通道和離子轉(zhuǎn)運(yùn)體如ROMK、ENaC、NCC及NKCC的調(diào)控。至于WNK1對與高血壓密切相關(guān)的Maxi K通道是否有調(diào)節(jié)作用，目前在國內(nèi)外報(bào)道很少。本研究團(tuán)隊(duì)已報(bào)道WNK4激酶能抑制Maxi K通道的的表達(dá)及分布[10]。所以我們設(shè)想，是否WNK1激酶對Maxi K通道亦存在調(diào)節(jié)作用。基于以上理論及研究思路，本研究在HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染攜帶WNK1和Maxi K基因的質(zhì)粒進(jìn)行研究。通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)WNK1能顯著增加Maxi K在細(xì)胞上的分布。而Western blot進(jìn)一步證實(shí)，WNK1能上調(diào)Maxi K的總蛋白表達(dá)水平，且隨著WNK1 DNA劑量的增加，上調(diào)作用逐漸增強(qiáng)，顯示其上調(diào)作用具有劑量依賴性。這些結(jié)果顯示W(wǎng)NK1激酶和Maxi K通道之間存在一種新的信號途徑。這也解釋了PHA I患者表現(xiàn)高血壓的可能機(jī)制，由于患者WNK1基因的缺失導(dǎo)致Maxi K通道表達(dá)的減少，不能維持血管SMC的靜息膜電位，從而導(dǎo)致高血壓的產(chǎn)生。和其它膜轉(zhuǎn)運(yùn)體或通道的功能可通過其轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的幾個(gè)可能機(jī)制被調(diào)節(jié)一樣，Maxi K通道表達(dá)的升高是由于其蛋白合成增加、或減少了蛋白的遷移、降解所致，目前尚不清楚。這也是我們下一步實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)，進(jìn)一步闡明其可能存在的機(jī)制。

我們相信，WNK1激酶對Maxi K通道的調(diào)節(jié)將是一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)，將對闡明高血壓的發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新的降壓藥作用靶點(diǎn)具有重要的意義，有助于設(shè)計(jì)新的高血壓治療方案，為高血壓患者提供更多更有效的治療藥物。

[1]XU B, ENGLISH J M, WILSBACHER J L, et a1.WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II[J].J Biol Chem, 2000, 275(22): 16795-16801.

[2]NAVARRO-ANTOJIN J, LEVITSKY K L, CALDERON E,

et al.Decreased expression of Maxi-K channel betal-subunit gene repression by hypoxia in cardiacmyocytes role in preconditioning[J].Circ Res, 2009, 104(12): 1364-1372.

[3]WILSON F H, DISSE-NICODèME S, CHOATE K A, et al.Human hypertension caused by mutations in WNK kinases [J].Science, 2001, 293(5532): 1107-1112.

[4]HOORN E J, NELSON J H, MC CORMICK J A, et al.The WNK kinases network regulating sodium, potassium, and blood pressure[J].J Am Soc Nephrol, 2011, 22(4): 605-614.

[5]MONTI J, ZIMDAHL H, SCHULZ H, et a1.The role of WNK4 in polygenie hypertension:acandidate gene analysis on rat chromosome[J].Hypertension, 2003, 41(4): 938-942.

[6]WILSON F H, KAHLE K T, SABATH E, et a1.Molecular pathogenesis of inherited hypertension with hyperkalemia: the Na-Cl cotransporter is inhibited by wild-type but not mutant WNK4[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(2): 680-684.

[7]KAHLE K T, RING A M, LIFTON R P, et a1.Molecular physiology of the WNK kinases[J].Annu Rev Physiol, 2008, 70: 329-355.

[8]NEWHOUSE S J, WALLACE C, DOBSON R, et a1.Haplotypea of the WNK1 gene associate with blood pressure variation in a severely hypertensive population from the British Genetics of Hypertension study[J].Hum Mol Genet, 2005, 14(13): 1805-1814.

[9]NAVARR-ANTOLIN J, LEVITSKY K I, CALDERON E, et a1.Decreased expression of Maxi K channel betal-subunit gene repression by hypoxia in cardiacmyocytes role in preconditioning[J].Circ Res, 2009, 104(12): 1364-1372.

[10]莊捷秋, 王德選, 張益前, 等.WNK4激酶通過溶酶體途徑抑制BK通道表達(dá)[J].中華腎臟病雜志, 2012, 28(4): 291-295.

（本文編輯：吳昔昔）

Investigation of the adjusting effect of WNK1 kinase on Maxi K channel

SHI Zhen1, ZHOU Lina2, ZHANG Yiqian1, WANG Dexuan3, ZHUANG Jieqiu3.
1.Department of Nephrology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Nephrology, Wenzhou People’s Hospital, Wenzhou, 325000; 3.Department of Pediatric Nephrology, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To investigate the adjusting effect of WNK1 kinase on Maxi K channel in HEK-293T cells.Methods: The DNA plasmid carrying WNK1 and Maxi K gene was transfected into the HEK-293T cells, to observe the distribution and total protein expression of Maxi K in the HEK-293T cells via immunofl uorescence microscopy and Western blot.Results: Immunofl uorescence microscopic study showed that Maxi K expression was markedly increased in experimental group compared with the control group.Western blotting analysis showed that total Maxi K protein level was markedly increased in the presence of experimental group 1 and experimental group 2 compared with the control group (P＜0.01).The total Maxi K protein level was markedly increased in experimental group 2 compared with the experimental group 1 (P＜0.05).Conclusion: WNK1 can upregulate total protein expression of Maxi K, and the effect is enhanced with the increasing amount of WNK1 DNA, showing that the effect was dose-dependent.

WNK1; Maxi K; pseudohypoaldosteronism II; hypertension

R544.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.003

2016-03-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81170709）；溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20150184）。

施珍（1982-），女，浙江麗水人，主治醫(yī)師，碩士。

莊捷秋，主任醫(yī)師，Email：jieqiuzhuang@hotmail.com。