周昌鉆，郭航遠，，孟立平，季政

（1.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035；2.紹興市人民醫(yī)院（浙江大學紹興醫(yī)院） 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000）

?論 著?

兩種原代培養(yǎng)方法對血管平滑肌細胞收縮表型的影響

周昌鉆1，郭航遠1，2，孟立平1，季政2

（1.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035；2.紹興市人民醫(yī)院（浙江大學紹興醫(yī)院） 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000）

目的：探究膠原酶消化法和植塊法培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞（VSMCs）對細胞收縮表型影響的特點。方法：使用I I型膠原酶消化法和植塊法分別離體培養(yǎng)原代VSMCs，并獲取第1代、第2代、第4代、第8代、第12代VSMCs，Western blot檢測不同代數(shù)表型標志蛋白α平滑肌肌動蛋白（SMA-α）、調(diào)寧蛋白（calponin）和骨橋蛋白（OPN）表達情況；隨后檢測不同培養(yǎng)方法間表型標志蛋白表達差異，并用劃痕實驗和MTT實驗檢測遷移、增殖水平，免疫熒光檢測SMA-α胞內(nèi)表達。結(jié)果：消化法最初可獲得明顯優(yōu)于植塊法的VSMCs收縮表型，表現(xiàn)為SMA-α和calponin高表達，OPN較低表達，增殖、遷移能力相對較弱。培養(yǎng)至第8代后，2種方法的細胞都發(fā)生顯著的表型改變，增殖、遷移能力增強且消化法細胞呈現(xiàn)更強的去分化表型趨勢。結(jié)論：I I型膠原酶消化法可快速獲得良好收縮表型的VSMCs，在第4代前具有優(yōu)于植塊法的收縮表型。[關(guān)鍵詞]血管平滑肌細胞；表型；細胞去分化；細胞分離；原代培養(yǎng)

正常血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）保持穩(wěn)定的收縮表型，但仍保持了重塑的潛力，在環(huán)境刺激下可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，是動脈粥樣硬化、高血壓、術(shù)后再狹窄等血管性疾病的病理基礎(chǔ)[1-2]。VSMCs去分化將失去明顯的梭形外形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)面積增加，重構(gòu)細胞外基質(zhì)能力增強，并伴有VSMCs標記蛋白α平滑肌肌動蛋白（smooth muscle actin-α，SMA-α）、調(diào)寧蛋白（calponin）、平滑肌肌凝蛋白重鏈（smooth muscle myosinheavy chain，SMHC）表達下調(diào)和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）表達上調(diào)[3-6]。但是國內(nèi)外關(guān)于VSMCs分離方法對細胞表型和后續(xù)實驗的影響仍未給予足夠重視。本研究用多種標志蛋白反映細胞去分化程度，比較膠原酶消化法和植塊法培養(yǎng)VSMCs對表型的影響，為不同實驗中VSMCs分離培養(yǎng)方法的選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 SPF級SD大鼠，雌雄不限，50 d左右，體質(zhì)量150～180 g（購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司）。I I型膠原酶（Sigma公司），75%乙醇（杭州化學試劑有限公司），DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA、100×青霉素和鏈霉素（Gibco公司），抗大鼠SMA-α單克隆抗體、OPN單克隆抗體、calponin單克隆抗體、β-actin單克隆抗體（Abcam公司），F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔IgG二抗、辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG二抗（Abbkine公司），DAPI（Rcohe公司），MTT（Emresco公司）。CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Nikon公司），低速離心機（合肥中佳醫(yī)療器械有限公司），組織剪、止血鉗（上海醫(yī)療器械集團有限公司手術(shù)器械廠），眼科剪、眼科鑷（蘇州六六視覺科技股份有限公司），顯微剪、顯微鑷（寧波成和顯微器械廠），25 cm細胞培養(yǎng)瓶（Corning公司）。

1.2 VSMCs的分離培養(yǎng)

1.2.1 植塊法培養(yǎng)VSMCs：將SD大鼠按0.2 mL/100 g腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉，無菌條件下分離胸腹主動脈，置于預(yù)冷DMEM培養(yǎng)基中，體視顯微鏡下刮除內(nèi)膜，彎鑷輕柔擠推血管分離中膜，迅速移入超凈臺并用鋒利的無菌剪刀將中膜剪成0.5～1 mm2的小塊，均勻鋪于細胞培養(yǎng)瓶底面，倒置細胞瓶并加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，后移至37 ℃細胞孵育箱中。2 h后翻轉(zhuǎn)細胞瓶使組織塊浸入液面，絕對靜置4 d后換液，接下來每4 d換液1次。培養(yǎng)1周后可見細胞游離出組織塊，培養(yǎng)2周后，細胞融合至80%后消化傳代，更換為10% FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 消化法培養(yǎng)VSMCs：將I I型膠原酶溶于無血清的DMEM培養(yǎng)基中，配成2 mg/mL的消化液。取血管中膜，剪成小塊，加入2 mL消化液，37 ℃水浴消化，每30 min輕柔吹打消化液，200目無菌鋼網(wǎng)濾過殘余組織，離心收集細胞，含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸??；殘余組織塊用巴氏管輕柔刮下后繼續(xù)置于消化液中，重復(fù)以上過程，約2 h后組織塊基本消化完全，將收集的細胞種植于6 cm多聚賴氨酸鋪被的培養(yǎng)皿中，移至細胞孵育箱48 h后換液，2 d后細胞融合至80%后消化傳代，并更換為含10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 MTT實驗 分別采用2種方法培養(yǎng)第2代和第8代原代細胞，以每孔6×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中。每組設(shè)3個復(fù)孔，待細胞貼壁后，無血清培

養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞同步化。將細胞于37 ℃、5% CO2孵育箱培養(yǎng)48 h。每孔含有100 μL培養(yǎng)基，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心棄去培養(yǎng)上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，選擇570 nm波長于酶標分析儀中測定各孔吸光度值并記錄。

1.4 劃痕實驗 取第2、第8代培養(yǎng)細胞，按每孔5×105個細胞數(shù)接種于6孔板中，待細胞鋪滿孔底后，無血清培養(yǎng)基同步化細胞8 h，然后加入1.8 mmol/L羥基脲抑制細胞增殖，避免細胞增殖帶來的假陽性結(jié)果。12 h后100 μL黃色槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，PBS沖洗孔板3次，更換培養(yǎng)基。分別記錄各組0、24 h圖片，用Image Pro Plus 6.0分析計算出細胞遷移的面積，細胞遷移面積與最初劃痕面積之間的比值來表示遷移能力。

1.5 Western blot測定VSMCs中標志蛋白的表達待第1代細胞融合至80%時，用0.25%胰酶消化、重懸浮細胞，200目鋼網(wǎng)濾過殘渣，濾液平均分為2管，隨后離心收集細胞。1管繼續(xù)傳代培養(yǎng)，另1管加入2倍沉淀體積的裂解液提取蛋白。第2、第4、第8、第12代細胞常規(guī)消化離心后，提取蛋白。蛋白經(jīng)上樣緩沖液混勻后沸水浴5 min，按每個孔道20 μg蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳。分別檢測各個樣品中SMA-α、OPN、calponin以及內(nèi)參β-actin表達情況。

1.6 細胞免疫熒光檢測VSMCs中SMA-α的表達 取2種方法第2代或第8代VSMCs，按每孔500個細胞種植于96孔板內(nèi)，用完全培養(yǎng)基孵育24 h使細胞完全貼壁，棄培養(yǎng)基后4%多聚甲醛固定1 h，PBS清洗后再用0.25% TritonX-100打孔，山羊血清室溫封閉1 h，分別用1∶250的SMA-α抗體4 ℃條件下孵育細胞過夜，PBS洗滌3次，F(xiàn)ICT標記山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，再用1 μg/mL DAPI染核，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察SMA-α分布表達。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，2組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗 2種方法培養(yǎng)的第2代VSMCs接種培養(yǎng)48 h后，以消化法與植塊法之間光密度（optical density，OD）值的比值反映增殖能力的強弱，消化法組增殖水平低于植塊法組，差異有統(tǒng)計學意義（1.00±0.16 vs.1.63±0.11，P＜0.05）；第8代細胞經(jīng)48 h培養(yǎng)后，2組細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義（1.00±0.14 vs.0.92±0.09，P＞0.05），見圖1。

2.2 劃痕實驗 分別取2種方法培養(yǎng)的第2代和第8代細胞行劃痕實驗，并根據(jù)24 h后細胞遷移面積與最初劃痕面積的比值反應(yīng)遷移水平。在第2代時，植塊法細胞較消化法表現(xiàn)出更強的遷移能力，差異有統(tǒng)計學意義（0.321±0.010 vs.0.399±0.026，P＜0.05），而培養(yǎng)至第8代后，兩者的遷移面積差異無統(tǒng)計學意義（0.449±0.023 vs.0.404±0.014，P＞0.05），見圖2。

圖1 MTT法檢測植塊法與消化法VSMCs增殖能力的差異

圖2 劃痕實驗檢測植塊法與消化法VSMCs遷移能力的差異

2.3 Western blot測定VSMCs標志蛋白表達 2種方法獲得的VSMCs隨著培養(yǎng)時間的延長，calponin 和SMA-α表達逐漸下降，OPN表達上調(diào)，在培養(yǎng)至第4代時，SMA-α和OPN與第1代VSMCs相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；繼續(xù)培養(yǎng)至第12代，calponin和SMA-α表達顯著下降，OPN表達上調(diào)明顯，見圖3。隨后檢測二者第2、第4、第8代VSMCs標志蛋白表達，發(fā)現(xiàn)消化法第2代細胞與植塊法相比，calponin、SMA-α表達較高而OPN表達較低；培養(yǎng)至第4代時消化法的細胞SMA-α表達仍高于植塊法；而calponin和OPN在二者間表達差異無統(tǒng)計學意義。培養(yǎng)至第8代時，消化法原代細胞calponin表達低于植塊法，而OPN表達高于植塊法（P＜0.05），SMA-α表達差異無統(tǒng)計學意義，見圖4。

圖4 不同方法VSMCs間標志蛋白表達差異檢測

2.4 細胞免疫熒光檢測VSMCs標志蛋白表達 細胞免疫熒光檢測原代VSMCs中SMA-α表達，發(fā)現(xiàn)第2代消化法細胞SMA-α表達明顯強于植塊法；培養(yǎng)至第8代時，二者的SMA-α表達都出現(xiàn)下調(diào)，而植塊法VSMCs的SMA-α表達表現(xiàn)出略高于消化法VSMCs的趨勢，見圖5。

圖5 免疫熒光檢測2種方法VSMCs在第2代和第8代時SMA-α蛋白表達情況（× 400）

3 討論

VSMCs在動物體內(nèi)高度特異分化，參與動物血壓維持和血流調(diào)節(jié)，表達一系列與收縮功能密切相關(guān)的特異蛋白。VSMCs在不同環(huán)境刺激下表型可轉(zhuǎn)化為合成型、巨噬細胞樣表型、鈣化表型等多種細胞表型[7-9]，其共同過程是VSMCs標志蛋白表達的改變。研究[10]發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣斑塊中82%的VSMCs 的SMA-α低表達或不表達，甚至其中部分表達巨噬細胞特異標志抗原。VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化后細胞的特性發(fā)生顯著改變，在一些藥理反應(yīng)上出現(xiàn)顯著差異。例如，史建紅等[11]發(fā)現(xiàn)合成型VSMCs對乙酰膽堿誘導(dǎo)的細胞收縮完全不敏感。血管緊張素I I處理收縮型VSMCs能迅速誘導(dǎo)細胞收縮，但對于已經(jīng)發(fā)生去分化的VSMCs，血管緊張素I I的這種作用則不甚明顯，同時更會選擇性誘導(dǎo)去分化VSMCs的凋亡[12]。因此，如何正常認識和在實驗中恰當選擇VSMCs的表型，是心血管疾病研究的重要基礎(chǔ)。

本研究中選用3種表型標志蛋白反映VSMCs表型轉(zhuǎn)化程度。SMA-α主要位于VSMCs微絲束中，是觀察細胞收縮功能和細胞骨架最常用的指標之一，而calponin作為肌動蛋白的結(jié)合蛋白也直接參與了細胞收縮機制，并且具有相當高的VSMCs特異性，因此兩者常被用于VSMCs細胞的鑒定[13-14]。OPN在正常血管壁中極低表達，當VSMCs受到病理刺激發(fā)生表型轉(zhuǎn)化后顯著增加，并且可顯著增強VSMCs遷移能力，并負性調(diào)控SMA-α和calponin表達[15-16]。外源性的OPN可參與維持VSMCs的去分化表型，因此常被作為反映VSMCs表型轉(zhuǎn)化程度的指標[17]。但研究發(fā)現(xiàn)，疾病狀態(tài)、組織修復(fù)、機體發(fā)育等過程都可影響這些標志蛋白的表達，甚至其他類型細胞在發(fā)育的某些階段也可表達部分VSMCs標志蛋白，因此VSMCs的鑒定常需要同時檢測多項標志蛋白[5，18]。

實驗結(jié)果顯示，I I型膠原酶消化法可短期內(nèi)獲得大量的收縮表型良好的VSMCs。與之相比，植塊法獲得的VSMCs已經(jīng)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。比較兩者間差異，我們推測原因可能在于膠原酶消化法直接分解細胞外基質(zhì)，使細胞從組織中釋放，可獲得最貼近正常表型的VSMCs，隨后再因為消化和血清的刺激，逐漸發(fā)生表型去分化。在第4代細胞及以前，消化法細胞在收縮表型上存在較明顯的優(yōu)勢。植塊法主要依靠VSMCs的增殖、遷移能力獲得細胞，導(dǎo)致了初期得到的細胞已經(jīng)過“篩選”，獲得的細胞以高增殖、高遷移的去分化VSMCs為主。

血小板衍生因子（platelet derived growth factor，PDGF）是細胞有效的有絲分裂誘導(dǎo)因子，并具有活化膠原酶的作用，常用于構(gòu)建VSMCs去分化模型[19-20]。研究[21]顯示，植塊法中添加PDGF-BB可將細胞游離出植塊的時間縮短2 d，且促進細胞快速增殖、融合?？梢?，植塊法中VSMCs培養(yǎng)效率和細胞表型之間存在一種直接關(guān)聯(lián)。

綜上所述，2種方法獲得的VSMCs在表型方面存在明顯差異，因此在生物學研究中應(yīng)根據(jù)研究目的的不同，準確使用相應(yīng)的VSMCs體外分離培養(yǎng)方法。I I型膠原酶消化法可迅速獲得大量收縮表型良好的原代細胞，在節(jié)約培養(yǎng)周期和保證成功率上有明顯優(yōu)勢，適合用于機體VSMCs信號通路調(diào)控、細胞因子影響、疾病危險因素等方面的研究，但建議在第4代或者更早培養(yǎng)時間的細胞用于實驗研究。植塊法作為經(jīng)典的VSMCs培養(yǎng)方法，操作手法對培養(yǎng)成功率影響較大，獲得的細胞已經(jīng)發(fā)生相當程度的表型轉(zhuǎn)化，可以用于疾病模型構(gòu)建、藥物治療效果的觀察等。

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（本文編輯：趙翠翠）

The infl uence of two vascular smooth muscle cell primary culture methods on cellular contractile phenotype

ZHOU Changzuan1, GUO Hangyuan1,2, MENG Liping1,2, JI Zheng2.
1.The First Clinical Medical College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Cardiology, Shaoxing People’s Hospital, Shaoxing Hospital of Zhejiang University, Shaoxing, 312000

Objective: To explore the difference between collagenase digestion method and explant-culture method to obtain vascular smooth muscle cells (VSMCs) primary culture on maintaining contractile phenotype.Methods: The 1st, 2nd, 4th, 8th, 12th generation of primary VSMCs were obtained via type II collagenase digestion and explant-culture method.VSMCs contractile phenotype protein markers, calopnin and smooth muscle actin-α (SMA-α), as well assecreted protein osteopontin (OPN), were detected by western blot between different generations.The migration and proliferation ability of VSMCs from two methods were detected by woundhealing assay and MTT assay, and the phenotype protein markers expression by immunofl uorescence and western blot.Results: We found VSMCs obtained from enzyme digestion initially exhibited stronger SMA-α and calponin expression, lower OPN expression and suppressed cellular proliferation and migration compared with that from explant-culture method.However, we observed a positive correlation between cell generation and VSMCs dedifferentiation degree, and a stronger dedifferentiation trend in enzyme digestion cells after 8th generation.Conclusion: Type II collagenase digestion method shows advantages in acquiring primary cells rapidly and maintaining VSMCs contractile phenotype within 4th generation compared with explant-culture method.

vascular smooth muscle cell; phenotype; cell dedifferentiation; cell separation; primary cell culture

Q254；Q2-33

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.001

2016-01-21

浙江省自然科學基金資助項目（LY14H020002）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生培育計劃（2015PYA013）。

周昌鉆（1991-），男，浙江溫州人，碩士生。

郭航遠，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，Email：ghang yuan@hotmail.com。