李自青,趙立峰,劉　宏

(1.山西大同大學醫(yī)學院,山西大同037009;2.山西大同大學呼吸病與職業(yè)病研究所,山西大同037009;3.天津市北辰區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展服務中心,天津北辰300400)

鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌二價滅活疫苗的制備和免疫效力試驗

李自青1,2,趙立峰3,劉宏1,2

(1.山西大同大學醫(yī)學院,山西大同037009;2.山西大同大學呼吸病與職業(yè)病研究所,山西大同037009;3.天津市北辰區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展服務中心,天津北辰300400)

為了研制鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌A型和C型二價滅活疫苗,對疫苗的免疫效力和免疫持續(xù)期以及疫苗保存期進行測定,從而為開發(fā)免疫原性較好的無毒副作用的滅活疫苗奠定基礎(chǔ).將產(chǎn)氣莢膜梭菌T5-A和J28-C株的培養(yǎng)液按1∶1混和,混合菌液按9∶1加入滅菌鋁膠,經(jīng)濃縮制備3批滅活疫苗0406-1,0406-2,0406-3.安全檢驗合格后,采用"血清中和試驗"檢驗技術(shù),進行家兔攻毒與血清抗體效價的平行試驗,測定疫苗的免疫效力和免疫持續(xù)期以及疫苗保存期.結(jié)果是疫苗的安全性良好,免疫效力表明疫苗的免疫保護率為100%,抗體效價顯示C型抗體效價高于A型,疫苗對C型菌的保護期長達6個月,而對A型菌的保護期為3個月.疫苗保存期的測定表明,疫苗可以保存10個月以上.表明3批疫苗安全性較好,對家兔有較強的免疫保護,為疫苗的下一步鹿田間試驗提供了理論依據(jù).

產(chǎn)氣莢膜梭菌;鹿滅活疫苗;疫苗制備;免疫效力

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種嚴重威脅人類和動物健康的病原菌.該菌在土壤、人以及動物腸道和糞便中廣泛存在,經(jīng)常由于深部創(chuàng)傷繼發(fā)感染,可引起人食物中毒和動物出血性腸炎[1].出血性腸炎是我國飼養(yǎng)鹿最常見的疾病,其死亡率占飼養(yǎng)鹿總死亡率的60%以上,給鹿養(yǎng)殖場造成很大的威脅[2].本試驗對產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗進行研制,并對疫苗的免疫效力和免疫持續(xù)期以及疫苗保存期進行了測定.旨在為開發(fā)免疫原性好且沒有毒副作用的二價鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗,為防止鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌病的流行奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1菌株和實驗動物疫苗制備菌種產(chǎn)氣莢膜梭菌T5-A和J28-C由本校微生物實驗室保存.健康家兔體重1.5～2 kg,ICR品系小鼠體重10～ 12 g,雌雄各半,由本校實驗動物中心提供.

1.2細菌培養(yǎng)和毒力測定產(chǎn)氣莢膜梭菌T5-A和J28-C菌株參照文獻[3]測定的最佳產(chǎn)毒條件在35℃培養(yǎng)7 h,取培養(yǎng)物(4℃)下4 000 r/min離心20 min,收集上清倍比稀釋后,每個劑量耳靜脈注射6只家兔,觀察家兔死亡情況,確定T5-A和J28-C菌株對家兔的最小致死量(MLD).同樣的方法測定菌株對小鼠的最小致死量(MLD).

1.3全菌滅活疫苗的制備將菌體培養(yǎng)液離心過濾除菌后,上清液用無菌1 mol/L NaOH調(diào)至pH值7.2,按體積比加入0.5%甲醛,37℃下脫毒5 d.經(jīng)滅活檢驗合格后,將產(chǎn)氣莢膜梭菌T5-A和J28-C株的培養(yǎng)液按1∶1混和.混合菌液按9∶1加入滅菌鋁膠,混勻,4℃下靜置10 d.棄1/2上清液,加入剩余量0.006%硫柳汞,混勻.無菌檢驗合格后,配苗分裝,制備3批產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗0406-1,0406-2,0406-3,4℃保存.

1.4疫苗安全檢驗按照《中國獸藥典》(2010版)[4]質(zhì)量檢驗方法對每種疫苗進行物理性狀和細菌性檢驗,合格后用3批疫苗分別接種體重1.5～2 kg健康家兔6只,每只頸部皮下注射4 mL,連續(xù)10 d觀察家兔局部或全身有無異常反應. 1.5免疫劑量測定取健康家兔60只,隨機分成3組,每組20只,疫苗0406-1采用頸部皮下注射,注射劑量分別為1 mL、2 mL、3 mL,同時取10只作為對照注射生理鹽水.免疫21 d后,每組20只平均分為兩個小組,分別用1MLD A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素耳靜脈注射進行攻毒,觀察7 d,根據(jù)家兔死亡情況確定最小免疫劑量,并計算保護率.

1.6免疫效力試驗3批疫苗以最小免疫劑量分別接種健康家兔20只,21 d后耳靜脈采血,將每組免疫家兔血清混合,取0.1 mL混合血清分別加入不同最小致死量(MLD)的A型菌和C型菌,混勻,37℃恒溫水浴40 min,然后尾靜脈注射小鼠,每組6只,每只0.3 mL,同時設(shè)立對照,根據(jù)小鼠死亡情況測定血清抗體效價.然后分別用1MLD A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素對家兔進行攻毒,計算保護率.

1.7免疫持續(xù)期試驗分別用3批疫苗免疫健康家兔,在免疫3個月、6個月及9個月后耳靜脈采血,測定血清抗體效價,方法同1.6.之后分別用1MLD A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素進行攻毒,觀察家兔死亡情況并計算保護率. 1.8疫苗保存期試驗3批疫苗在4℃～10℃保存8、10、12個月后,分別取出免疫家兔,免疫21 d后,分別用A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素進行攻毒,攻毒劑量為1MLD,觀察家兔死亡情況.

2　結(jié)果

2.1試驗菌株毒力測定毒力測定結(jié)果顯示,產(chǎn)氣莢膜梭菌對家兔的MLD:T5-A為1.5 mL,J28-C為0.025 mL.對小鼠的MLD:T5-A為0.025 mL,J28-C為0.001 mL.

2.2安全性檢驗制備的疫苗物理性狀呈均勻的混懸液,無菌檢驗呈陰性.3批疫苗接種的家兔食欲正常,精神狀態(tài)良好,體溫未升高,無全身不良反應,注射部位無潰爛,僅個別家兔局部出現(xiàn)輕微的肉芽腫,表明疫苗無毒,安全性較好.

2.3最小免疫量試驗不同劑量疫苗免疫家兔后的攻毒結(jié)果顯示,免疫劑量1 mL(8X1010CFU)時疫苗保護率為60%～70%(6/10～7/10),免疫劑量為2 mL和3 mL的保護率均達到100%(10/10),說明疫苗的最小免疫劑量為2 mL.

2.4免疫效力試驗和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素對免疫組家兔和對照組進行攻毒,結(jié)果表明,疫苗的免疫保護率均為100%(10/10).血清抗體效價結(jié)果顯示,A型毒素1MLD～3MLD劑量測毒時,小鼠存活,4MLD～6MLD劑量時,小鼠死亡;C型毒素1MLD～4MLD劑量時,小鼠存活,5MLD～ 6MLD劑量時,小鼠死亡;陽性對照小鼠全部存活,陰性對照小鼠死亡.表明C型抗體效價為4MLD,A型抗體效價為3MLD,提示我們疫苗對C型菌的免疫保護可能高于A型.

2.5免疫持續(xù)期試驗3批疫苗(0406-1,0406-2,0406-3)免疫家兔后,攻毒結(jié)果顯示,3個月后疫苗對A型菌和C型菌的保護率都為100%(10/ 10),6個月后對A型菌的保護率降低到60%～ 70%(6/10～7/10),而對C型菌的保護率仍為100%(10/10),9個月后對A型菌保護率降低到20%～30%(2/10～3/10),對C型菌保護率為60%～70%(6/10～7/10).血清抗體效價測定結(jié)果顯示,免疫3個月后與初免疫后抗體效價保持不變,A型為3MLD,C型為4MLD;免疫后6個月抗體效價下降,A型為1MLD,C型為2MLD;免疫后9個月A型為0,C型為1MLD.表明疫苗的保護效率與血清抗體效價保持一致.2.6疫苗保存期試驗疫苗在4℃～10℃保存8個月、10個月疫苗對A型菌和C型菌的保護率均為100%(10/10),但保存12個月后疫苗對A型菌的保護率降低到30%～50%(3/10～5/10),對C型菌的保護率降低到50%～70%(5/10～7/10).

3　討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌病對家畜養(yǎng)殖業(yè)的危害非常嚴重,其中鹿出血性腸炎就是危害鹿養(yǎng)殖業(yè)最為嚴重的疾病之一,在20世紀90年代曾經(jīng)給山西的鹿養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失.該病一旦發(fā)病,病死率極高,疫苗防控是最有效的辦法.疫苗的有效防控程度取決于制備疫苗的菌株與發(fā)病流行的菌株抗原的親緣關(guān)系[5].本研究在采集山西省內(nèi)各養(yǎng)鹿場因出血性腸炎而病死鹿病料,分離并鑒定其病原菌是A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的基礎(chǔ)上,制備了產(chǎn)氣莢膜梭菌A型菌和C型的二價滅活疫苗,以鋁膠為佐劑,通過安全性和免疫效力檢驗,表明疫苗的安全性良好,對A型菌和C型菌的保護率均達到100%,對A型菌的保護期是3個月而對C型菌的保護期可長達6個月,疫苗可以保存10個月以上;表明疫苗符合《獸藥典》規(guī)定的質(zhì)量標準.鋁膠雖然作為免疫佐劑被廣泛應用,但抗原免疫原性弱時,不能夠很好的提高免疫原性,而且不能介導細胞免疫反應[6].所以下一步將篩選更適宜的佐劑,進一步提高疫苗的免疫原性.

滅活疫苗的效力檢驗以往一直采用本動物攻毒法,這種方法成本高,周期長,而且程序復雜[7].本試驗采用"血清中和試驗"的檢驗技術(shù),進行了家兔攻毒與血清抗體效價的平行試驗.血清抗體效價測定中C型抗體效價高于A型抗體,免疫攻毒時,疫苗對C型菌的保護優(yōu)于A型菌.說明用"血清中和試驗"來代替"本動物攻毒"的效力檢驗技術(shù)可行.這種技術(shù)的應用不僅可以節(jié)省成本、縮短周期,而且操作方便,尤其適用于對多價疫苗的檢驗,從而為今后的疫苗檢驗奠定基礎(chǔ).

[1]Qiu H,Chen F,Leng X,et al.Toxinotyping of Clostridium per?fringens fecal isolates of reintroduced Père David's deer(Elaphur?us davidianus)in China[J].J Wildl Dis,2014,50(4):942-945.

[2]鐘震宇,張林源,唐寶田.2000-2009年北京南海子麋鹿出血性腸炎發(fā)生特點分析[J].畜牧與獸醫(yī),2013,45(4):56-58.

[3]趙立峰,郭宏偉,任家琰,等.A型產(chǎn)氣莢膜桿菌產(chǎn)毒條件的測定[J].經(jīng)濟動物學報,2005,9(2):100-102.

[4]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[S].三部.2010年版.

[5]Belikov S I,Kondratov I G,Potapova U V,et al.The relation?ship between the structure of the tick-borne encephalitis vi?rus strains and their pathogenic properties[J].PLoS One,2014,9 (4):e94946.

[6]Mody K T,Popat A,Mahony D,et al.Mesoporous silica nanopar?ticles as antigen carriers and adjuvants for vaccine delivery[J].Na?noscale,2013,5(12):5167-5179.

[7]曲海波,劉洪斌,白同臣,等.A型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗與全菌滅活疫苗的安全性和免疫效力的比較研究[J].中國獸藥雜志,2010,44(2):15-16.

Preparation and immunity test of two bivalent inactivated vaccineof Clostridium perfringens from deer

LI Zi-qing1,2,ZHAO Li-feng3,LIU Hong1,2
(1.Medical College of Shanxi Datong University,Datong 037009,China; 2.Respiratory and Occupational Disease Research Institute of Shanxi Datong University,Datong 037009,China; 3.The service center for development of aquaculture industry in beechen district in tianjin,Tianjin 300400,China)

To develop a bivalent inactivated vaccine of Clostridium perfringens type A and C from deer,we measured the vac?cine immune efficacy and duration and vaccine storage period.Culture solution of Clostridium perfringens T5-A and J28-C was mixed with 1∶1,and then mixed the bacteria liquid with the disinfectant gel at a ratio of 9∶1.And three batches of inactivated vac?cine 0406-1/0406-2/0406-3 were prepared.After safety inspection"serum neutralization test,vaccine immune efficacy and dura?tion period and vaccine storage period were tested.Vaccine was good safety,and protection rate for Clostridium perfringens type A and C was 100%.The antibody titer of type C was higher than type A,and the vaccine protection for type C strains was up to 6 months,and type A was 3 months.The vaccine could be kept for more than 10 months.The three batches of vaccine have good safe?ty,and a strong immune protection to the rabbits.

Clostridium perfringens;Inactivated vaccine of deer;Preparation;immunity test

LIU Hong

S852.4

A

0529-6005(2016)06-0025-03

2015-09-10

大同市科技攻關(guān)計劃項目(201361)

李自青(1980-),女,講師,碩士,主要從事分子生物學與腫瘤免疫學研究,E-mail:liziqing_1234@163.com

劉宏,E-mail:a-liuhong@163.com