劉寶山，張文奎，尹榮煥（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

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恒溫解旋擴(kuò)增技術(shù)的改進(jìn)和發(fā)展

劉寶山，張文奎，尹榮煥
（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

恒溫解旋擴(kuò)增技術(shù)（Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）是紐英倫生物實(shí)驗(yàn)室美籍華人KONG Hui-min于2004年發(fā)展建立的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[1]，它模仿生物體內(nèi)DNA的合成，在恒溫條件下（62℃或37℃）憑借解旋酶解開(kāi)雙鏈DNA，然后引物與模板特異性結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下合成互補(bǔ)鏈，進(jìn)行特異性基因的擴(kuò)增[2]。

與普通PCR技術(shù)相比，HDA不需要昂貴的PCR儀，擴(kuò)增在同一溫度下進(jìn)行，無(wú)溫度變化時(shí)間間隔，反應(yīng)時(shí)間明顯縮短，采用的聚合酶不易引起非特異性擴(kuò)增，具有高度的敏感性，非常有利于在條件差的基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的發(fā)展前景[3]?，F(xiàn)在已有多種應(yīng)用HAD進(jìn)行疫病檢測(cè)的報(bào)道[4-6]。

然而，HDA技術(shù)也有擴(kuò)增片段較短、只擴(kuò)增DNA等一些不足，但人們?cè)谶@些方面對(duì)其又進(jìn)行了一系列的改進(jìn)和研究，使其性能更加優(yōu)異，更符合臨床檢測(cè)的要求。

1　反應(yīng)速度方面的改進(jìn)

最初，HDA中經(jīng)常使用的是大腸桿菌UvrD解旋酶，其解鏈速度為20 bp/s，連續(xù)性為100 bp左右[7-8]，解鏈能力較低，使得HDA擴(kuò)增序列的長(zhǎng)度只有70～120 bp左右。這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們基因擴(kuò)增的要求，需要找到一種解鏈能力更強(qiáng)的解旋酶。2006年Yan Xu等發(fā)現(xiàn)了一種新的解旋酶（噬菌體T7基因4蛋白），其解鏈速度為300 bp/s，使得HDA擴(kuò)增DNA的長(zhǎng)度達(dá)到2.5 KB[9]，滿足了常規(guī)基因擴(kuò)增和檢測(cè)的需要。

2008年Motre等通過(guò)使用一個(gè)卷曲螺旋連接頭將TteUvrD螺旋酶（Thermoanaerobacter tengcongensis UvrD helicase）和Bstpol聚合酶（Bacillus stearothermophilus DNA polymerase I Large Fragment）連接起來(lái)，構(gòu)建了一種融合酶helimerase，同時(shí)具有TteUvrD和Bstpol的活性；而且在恒溫解旋擴(kuò)增反應(yīng)中比單獨(dú)添加TteUvrD和Bstpol能合成更長(zhǎng)的擴(kuò)增片段[10]。

2　檢測(cè)模板方面的改進(jìn)

2006年Yan Xu等在HDA的基礎(chǔ)上創(chuàng)建了一種可直接擴(kuò)增完整環(huán)狀質(zhì)粒的環(huán)HDA法（The circular helicasede-pendent amplification，cHDA）[9]，讓基因擴(kuò)增和篩選同步完成，不但可以用在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中減少分析和構(gòu)建質(zhì)粒DNA的時(shí)間、提高產(chǎn)量，而且可以用于進(jìn)行參與感染線形DNA的環(huán)狀DNA的檢測(cè)。而且，cHDA法的反應(yīng)溫度為25℃，在室溫下就可進(jìn)行，是一種實(shí)用的恒溫基因擴(kuò)增方法。

為能夠擴(kuò)增檢測(cè)RNA，2007年Goldmeyer等建立了反轉(zhuǎn)錄恒溫解旋擴(kuò)增技術(shù)（isothermal reverse transcription-thermophilic helicase-dependent amplification，RT-tHDA），試驗(yàn)表明，其具有很高的敏感性和特異性。通過(guò)添加一種特殊的熱穩(wěn)定的單鏈結(jié)合蛋白建立的一步RT-tHDA反應(yīng)體系，可以在不到10分種的時(shí)間內(nèi)將埃博拉病毒（Ebola virus）的RNA擴(kuò)增百萬(wàn)倍[11]。

2011年Doseeva等報(bào)道了一種多重HDA，可以同時(shí)進(jìn)行沙眼衣原體和淋病奈瑟球菌的擴(kuò)增，顯示了很好的敏感性和特異性，并且可以對(duì)多種樣品和培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，這種方法非常適合臨床進(jìn)行自動(dòng)和高通量的檢測(cè)[12]。

3　HDA與其他技術(shù)的聯(lián)用

3.1HDA與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的聯(lián)用2007年，Gill等將恒溫解旋擴(kuò)增技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)聯(lián)合起來(lái)，對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)ureC的引物，使用異羥洋地黃毒苷配基（DIG）標(biāo)記的等溫?cái)U(kuò)增程序?qū)?xì)菌的DNA進(jìn)行了擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)生的帶有DIG標(biāo)簽的擴(kuò)增產(chǎn)物熱變性后同特異性的生物素標(biāo)記的DNA探針雜交，DNA探針以非共價(jià)鍵的方式被固定在抗生物素蛋白鏈菌素包被的微量滴定板上。然后使用HRP標(biāo)記的抗DIG抗體以及底物進(jìn)行了比色測(cè)定。來(lái)源于胃組織的樣本的測(cè)定結(jié)果同細(xì)菌培養(yǎng)相比分別具有90%和95.7%的敏感性和特異性。和其他的組織學(xué)研究相比分別具有96.6%和96.8%的敏感性和特異性[13]。2008年其又將納米金探針和HDA相結(jié)合建立了檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌的方法，使用納米金標(biāo)記的探針和HDA產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交而形成的顏色使用比色法進(jìn)行檢測(cè)[14]。這種方法可以在1 h內(nèi)最低檢測(cè)到10 CFU/mL的幽門(mén)螺桿菌，同細(xì)菌培養(yǎng)相比分別具有92.5%和95.4%的敏感性和特異性。和其他的組織學(xué)研究相比分別具有100%和98.8%的敏感性和特異性。這兩種方法操作都很容易，可以顯著地節(jié)省幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)的時(shí)間和成本，在疾病的早期檢測(cè)中具有很大的潛力。

3.2HDA與微陣列技術(shù)的聯(lián)用為滿足快速、特異、敏感地進(jìn)行多項(xiàng)目檢測(cè)的需要，2009年Andresen等發(fā)展了一種新的病原檢測(cè)方法-解旋酶依賴性的芯片擴(kuò)增技術(shù)（helicase dependent OnChip amplification，OnChip-HDA），其將恒溫解旋擴(kuò)增技術(shù)和微陣列進(jìn)行結(jié)合，使基因分析和檢測(cè)整合在一個(gè)反應(yīng)中，在多病原檢測(cè)中節(jié)省了時(shí)間和成本[15]。使用OnChip HDA方法對(duì)兩種病原-淋球菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)證實(shí)了這些優(yōu)點(diǎn)。其在反應(yīng)裝置上的簡(jiǎn)易性以及集約化和多病原分析中的潛力使其在小型實(shí)驗(yàn)室的芯片系統(tǒng)以及現(xiàn)場(chǎng)診斷中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。2012年Frech，G C等將HDA和芯片雜交技術(shù)相結(jié)合檢測(cè)了鼻腔內(nèi)金黃色葡萄球菌的攜帶情況，結(jié)果和細(xì)菌分離相比整體的相對(duì)敏感性為89%，特異性為94%[16]。

3.3HDA與核酸提取技術(shù)的聯(lián)用2010年Mahalanabis報(bào)道了一種將核酸提取和HDA整合在一起的一次性檢測(cè)裝置[17]。在這個(gè)裝置中，細(xì)菌裂解、核酸提取和核酸擴(kuò)增整合在一起組成一個(gè)筒形的聚合體，使用一個(gè)活門(mén)和一個(gè)疏水的聚四氟乙烯薄納米孔膜進(jìn)行液體的控制，以熒光指示劑反映是否出現(xiàn)核酸擴(kuò)增。這個(gè)裝置可減少使用者的多次操行，并且可以最低檢測(cè)到10個(gè)CFU的大腸桿菌。

3.4HDA與生物傳感器技術(shù)的聯(lián)用2011年Torres-Chavolla等還將DNA基的生物傳感器和tHDA結(jié)合起來(lái)用來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，借助于便攜式的手提穩(wěn)壓器可應(yīng)用于偏遠(yuǎn)的實(shí)驗(yàn)室[18]。

3.5HDA與電化學(xué)技術(shù)的聯(lián)用2011年Kivlehan等還報(bào)道了使用電化學(xué)方法進(jìn)行HDA擴(kuò)增結(jié)果的實(shí)時(shí)檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)嵌入了氧化還原電極的指示DNA的電流下降反應(yīng)來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。這種方法不但可以進(jìn)行不足1h內(nèi)的目標(biāo)核酸的定量分析，而且可以進(jìn)行在擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)進(jìn)行DNA融解曲線的分析來(lái)區(qū)分特異性和非特異性擴(kuò)增。這種檢測(cè)方法非常適合發(fā)展為一種簡(jiǎn)單、確切、低廉并且高通量的檢測(cè)裝置，以取代更加復(fù)雜和昂貴的基于熒光的檢測(cè)方法[19]。

3.6HDA與蛋白質(zhì)技術(shù)的聯(lián)用2013年Cao，A等使用一個(gè)帶有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的發(fā)夾探針將蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)換成DNA信號(hào)，借助核酸外切酶將多余的探針消化后進(jìn)行HDA，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子的零背景信號(hào)擴(kuò)增。該方法具有良好的特異性和靈敏度，能最低檢測(cè)到9.3×10-13M的轉(zhuǎn)錄因子，超過(guò)常用的檢測(cè)方法4個(gè)數(shù)量級(jí)[20]。

綜上所述可以看出，HDA作為一種新的恒溫基因擴(kuò)增方法，具有自身獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)與相關(guān)技術(shù)整合聯(lián)用，可以實(shí)現(xiàn)多種研究應(yīng)用中的基因擴(kuò)增，相信在不久的將來(lái)其必將得到廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

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作者簡(jiǎn)介：劉寶山（1975-），男，講師，博士，從事動(dòng)物疫病的診斷和防治，E-mail：18698890218@163.com

收稿日期：2014-11-26

中圖分類(lèi)號(hào)：S854.43

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0075- 02