于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬流感的流行現(xiàn)狀及分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展

于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬流感是由豬流感病毒引起的一種急性、高度接觸性豬呼吸道傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的危害，豬流感病毒也可感染人類，威脅人類的生命健康。文內(nèi)通過(guò)綜述我國(guó)豬流感的流行現(xiàn)狀及分子生物學(xué)診斷方法的研究進(jìn)展情況，以期對(duì)豬流感的診斷和防控工作提供參考。

豬流感；流行現(xiàn)狀；分子生物學(xué)；診斷

豬流感(swine influenza，SI)是由豬流感病毒(swine influenza virus，SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病。該病有明顯的季節(jié)性，早春、深秋和寒冷的冬季多發(fā)，各種年齡、性別和品種的豬均可感染[1]，臨床表現(xiàn)主要是發(fā)病急、呼吸困難、咳嗽、流淚、鼻液增多、衰竭、低死亡率等[2]。SIV可損害豬免疫系統(tǒng)，引起免疫抑制，繼發(fā)感染其他疾病，加劇病情，降低生產(chǎn)性能，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于豬呼吸道內(nèi)同時(shí)具有人流感和禽流感的唾液酸受體，因此，豬是禽、豬、人流感病毒共同易感宿主，是流感病毒基因重組或重配的“混合器”[3]，豬流感的公共衛(wèi)生學(xué)意義日益突出，在流感大流行中起著重要的作用[4]。本文簡(jiǎn)要綜述了近年來(lái)我國(guó)豬流感的流行現(xiàn)狀與SIV分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展情況，希望廣大基層獸醫(yī)工作者對(duì)SI引起足夠的重視，從而建立有效的診斷和防控機(jī)制，最大程度地減輕SI對(duì)養(yǎng)豬業(yè)所造成的危害。

1 我國(guó)豬流感流行現(xiàn)狀

1918年美國(guó)首次報(bào)道了豬流感[5]，迄今為止，歐、美、非、亞、澳等世界各大洲均有豬流感的發(fā)生和流行。目前，已經(jīng)分離的血清型有H1N1、H1N2、H2N3、H3N1，H3N2、H1N7、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等，在我國(guó)豬群中流行較廣的主要是H1N1，H1N2和H3N2，也有H5N1和H9N2感染豬的相關(guān)報(bào)道[6-7]。王進(jìn)香等[8]采用血凝抑制試驗(yàn)(HI)對(duì)寧夏22個(gè)縣(區(qū)、市)43個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)、10個(gè)屠宰場(chǎng)、197個(gè)散養(yǎng)戶的1 710份豬血清樣品進(jìn)行了豬流感病毒H1、H3亞型抗體的檢測(cè)。結(jié)果顯示，被調(diào)查的樣品中，H1亞型抗體陽(yáng)性率為11.81%，H3亞型抗體陽(yáng)性率為0.46%，H1+H3亞型抗體陽(yáng)性率為0.35%。劉旭等[9]對(duì)甘肅省14個(gè)地、市、州規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)未免疫流感疫苗的380份豬血清進(jìn)行了豬流感H1N1、H3N2、H5和H9抗體檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多個(gè)市、州的豬群中檢出H1N1、H3N2、H5和H9抗體，陽(yáng)性率分別為35.26%、28.15%、1.05%和7.89%。陳錦成等[10]采用HI對(duì)采集于廣東、湖南、河南省12個(gè)市縣28個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的799份血清進(jìn)行H1和H3亞型豬流感病毒的抗體檢測(cè)。結(jié)果表明，H1亞型抗體陽(yáng)性率在0～83.33%之間，豬抗體總陽(yáng)性率為46.18%(369/799)，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為89.29%(25/28)。H3亞型抗體陽(yáng)性率在0～100.00%之間，豬抗體總陽(yáng)性率為61.33%(490/799)，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為85.71%(24/28)。廣東、湖南和河南地區(qū)H1亞型抗體陽(yáng)性率分別為48.91%、40.26%和50.67%，H3亞型抗體陽(yáng)性率分別為58.55%、70.78%和 78.67%。在被調(diào)查的上述3個(gè)地區(qū)的豬群中，H1和H3亞型豬流感病毒的感染較為普遍，其中H3亞型感染率高于H1亞型，且各地區(qū)豬流感病毒的流行情況存在地域性差異。李凱航等[11]2011年對(duì)上海市46個(gè)場(chǎng)戶的723份豬血清應(yīng)用HI和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示：該市豬群中豬流感病毒的H1亞型為優(yōu)勢(shì)亞型，H3亞型病毒感染率較低，被檢場(chǎng)戶流感病毒抗體的場(chǎng)陽(yáng)性率為1.25%～100%，樣品陽(yáng)性率為1.3%～74.7%。曹振鵬等[12]采用ELISA方法和HI對(duì)2011—2012年采集的1 050份血清樣品進(jìn)行SIV血清學(xué)檢測(cè)。兩種檢測(cè)方法結(jié)果顯示1 050份血清樣品中SIV抗體陽(yáng)性率分別為50.4%(ELISA)和50.2%(HI)。其中珠三角地區(qū)和粵東地區(qū)的感染率高于粵西地區(qū)。SIV亞型調(diào)查結(jié)果顯示該地區(qū)流行的SIV主要為H1和H3亞型，抗體陽(yáng)性率分別為39.2%和18.2%(ELISA)。部分豬場(chǎng)存在H9亞型SIV抗體。部分豬群中同時(shí)存在H1和H3兩種亞型SIV抗體，表明豬群中存在不同亞型SIV混合感染。劉麗萍等[13]于2012年10月至2013年12月從全國(guó)養(yǎng)豬重點(diǎn)省份的養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)采集豬血清樣品共計(jì)5 856份，采用HI進(jìn)行豬流感抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示，我國(guó)豬群中SIV抗體陽(yáng)性率分別為55.52%、13.92%和2.00%，其中H1N1 SIV抗體平均陽(yáng)性率高于其他亞型。2013年1月和3月份，又集中在廣東和湖南兩個(gè)省份的部分養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)采集豬血清樣品共計(jì)9 910份，采用ELISA進(jìn)行抗體檢測(cè)。結(jié)果共檢出陽(yáng)性血清3 518份，平均陽(yáng)性率分別為36.14%和34.89%。王剛等[14]于2009—2014年期間分別從西藏林芝、拉薩、山南、日喀則、昌都和那曲等地區(qū)隨機(jī)采集豬血清1 537頭份，采用ELISA法進(jìn)行抗體檢測(cè)。結(jié)果表明：西藏地區(qū)SIV H1N1抗體陽(yáng)性率達(dá)71%，SIV H3N2抗體陽(yáng)性率達(dá)27%，SIV H1N1和H31N2抗體陽(yáng)性重復(fù)率達(dá)19%。何淑儀等[15]采用HI，對(duì)2013—2014年從5個(gè)省份采集的2 208份血清樣品進(jìn)行SIV血清學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性血清共1 269份(57.42%)，其中廣東省和廣西省的感染率最高(P＜0.01)。H1N1 SIV、H3N2 SIV抗體陽(yáng)性率分別為22.51%、32.97%。H1N1 SIV和H3N2 SIV在冬季血清陽(yáng)性率最高，然而在冬末(2月)陽(yáng)性率卻最低(P ＜0.01)。母豬的H1N1 SIV抗體陽(yáng)性率高于仔豬和育肥豬，但仔豬的H3N2 SIV抗體陽(yáng)性率卻比較高。隋金鈺等[16]分別對(duì)2013年11-12月期間采集于福建等9個(gè)重點(diǎn)養(yǎng)豬省份的2 198份以及2014年3-4月期間采自于廣東和湖南兩省的3 654份豬血清樣品進(jìn)行了血凝抑制抗體的檢測(cè)。結(jié)果顯示，2013年我國(guó)豬群中歐亞類禽型豬H1N1、2009/H1N1、H3N2 SIV、H5N1 AIV、H9N2 AIV及H7N9流感病毒平均抗體陽(yáng)性率分別為49.73%、11.87%、1.71%、0、0、1.36%，2014年分別為48.52%、12.10%、1.04%、0、0、2.05%。

2 豬流感病毒分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展

2.1 核酸探針

核酸探針技術(shù)是常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，它具有操作簡(jiǎn)單，不受抗原抗體反應(yīng)的限制，結(jié)果易于判定等優(yōu)點(diǎn)。Junk等用非放射性地高辛標(biāo)記的582個(gè)堿基cDNA探針來(lái)檢測(cè)A型H1N1 SIV編碼核蛋白的RNA，陽(yáng)性細(xì)胞呈明顯的暗黑色，證明該探針有較好的特異性和敏感性。呂翠等[17]以地高辛標(biāo)記SIV基質(zhì)蛋白(M)基因的保守片段制成核酸探針，與H1及H3亞型的SIV的cDNA、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的cDNA、豬圓環(huán)病毒2型的DNA、豬瘟病毒cDNA、豬偽狂犬病的DNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，以檢測(cè)探針的特異性，結(jié)果該探針僅與H1及H3亞型的SIV的cDNA雜交呈陽(yáng)性，與其余病毒雜交呈陰性，敏感性試驗(yàn)顯示，探針最低能檢出約5 pg的H3亞型的SIV RT-PCR產(chǎn)物，應(yīng)用該探針對(duì)35份疑似SI臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出9份陽(yáng)性，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

2.2 RT-PCR方法

RT-PCR是以病毒的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR進(jìn)行核酸擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)病毒的方法，以其簡(jiǎn)便、迅速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)在動(dòng)物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。王隆柏等[18]根據(jù)GenBank發(fā)表H1N1、H1N2和H3N2亞型豬流感病毒M基因片段的引物序列，設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物，建立豬流感病毒RTPCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該法能擴(kuò)增出675 bp的基因片段，同條件擴(kuò)增的偽狂犬病毒、豬瘟病毒、圓環(huán)病毒2型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒均為陰性，可檢測(cè)到3.5 pg豬流感的核酸，能從被流感病毒感染的小白鼠和疑似豬流感的病料中檢測(cè)到SIV。

2.3 多重RT-PCR方法

多重PCR是在單一PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，通過(guò)寡核苷酸引物組合，在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶序列，其擴(kuò)增的特異性和效率與單一PCR相當(dāng)，但同時(shí)可擴(kuò)增針對(duì)不同模板的多個(gè)靶序列，能節(jié)約時(shí)間和精力。齊海濤等[19]根據(jù)GenBank中H1N1和H3N2亞型SIV血凝素、神經(jīng)氨酸酶和M基因保守序列，分別設(shè)計(jì)合成了5對(duì)特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)對(duì)SIV的型和亞型進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，該方法的型RT-PCR可以檢測(cè)出104EID50病毒量所提取的RNA，H1、H3、N1和N2的亞型RT-PCR均可以檢測(cè)出104EID50病毒量所提取的RNA。除每對(duì)特異性引物所對(duì)應(yīng)的亞型外，對(duì)其他亞型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒的檢測(cè)均為陰性。王洪光等[20]根據(jù)GenBank登錄的相關(guān)病毒基因序列，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了可同時(shí)檢測(cè)以豬繁殖與呼吸綜合征病毒與SIV的RT-PCR診斷方法，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度分別為364 bp和981 bp。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該方法具有良好的特異性和較高的敏感性，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒和SIV的核酸檢測(cè)最低濃度分別為3.2×10-3ng和2.7×10-3ng。應(yīng)用該方法對(duì)32份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽(yáng)性率為43.8%，SIV陽(yáng)性率為31.3%，二重感染率為9.4%。韋冠東等[21]根據(jù)GenBank登錄的相關(guān)病毒基因序列，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了可同時(shí)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒與SIV的三重RT-PCR診斷方法，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度分別為364 bp、530 bp和981 bp。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該方法具有良好的特異性和較高的敏感性，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和SIV的核酸檢測(cè)最低濃度分別為3.2×10-2ng、8.3×10-2ng和3.7×10-2ng。

2.4 熒光定量RT-PCR方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。張?zhí)璧萚22]選取SIV的核蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了檢測(cè)SIV的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。以梯度稀釋的含有SIV目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)以確定檢測(cè)靈敏度。2.0×108至2.0×102拷貝/μL 7個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)定量PCR有“S”型擴(kuò)增曲線，檢測(cè)靈敏度為20個(gè)拷貝/μL，并根據(jù)病毒拷貝數(shù)與Ct值的關(guān)系繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法具有特異性，對(duì)豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸都沒(méi)有擴(kuò)增反應(yīng)。劉好朋等[23]根據(jù)H1亞型SIV血凝素基因保守序列，分別設(shè)計(jì)并合成1對(duì)特異性引物和1條TaqMan MGB探針，建立檢測(cè)H1亞型SIV的一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)。結(jié)果顯示，該方法的敏感性可達(dá)102拷貝/ μL，除H1亞型SIV外，對(duì)H3N2亞型SIV、H9N1亞型SIV、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒的檢測(cè)均為陰性，且應(yīng)用該方法對(duì)疑似豬流感樣品進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與SPF雞胚分離病毒方法結(jié)果的符合率為94%。王建華等[24]分別根據(jù)尼帕病毒(NiV)和SIV的M基因序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan-MGB探針，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件建立了一種鑒別NiV和SIV的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)該方法的定量線性范圍、敏感性、重復(fù)性和特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)及初步應(yīng)用。結(jié)果顯示，用該方法檢測(cè)NiVM基因的RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照(NiV-M-RNA)和SIVM基因的RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照(SIV-M-RNA)，定量線性范圍分別為4.6×101copies/ μL-4.6×108copies/μL和 5.8× 101copies/μL-5.8×108copies/μL，檢出限分別為46個(gè)拷貝和58個(gè)拷貝。該方法的組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于1.6%，顯示其良好的可重復(fù)性。該方法僅對(duì)NiV-M-RNA和SIV呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，不與豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型和偽狂犬病病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一項(xiàng)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、敏感、特異等特點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場(chǎng)和基層部門應(yīng)用。蘇霞等[25]從GenBank中獲得H1N1 SIV血凝素、神經(jīng)氨酸酶基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件MegAlign程序分析其序列，利用Primer ExplorerV4軟件在序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)LAMP引物，即外引物和內(nèi)引物，同時(shí)以H1N1 SIV的cDNA作為陽(yáng)性模板，對(duì)實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。建立H1N1 SIV LAMP快速檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該法對(duì)H1N1 SIV的靈敏度達(dá)到4～6個(gè)拷貝，其引物對(duì)于H9亞型禽流感病毒、豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒均無(wú)非特異性擴(kuò)增，表現(xiàn)出良好的特異性。張莉等[26]針對(duì)SIV NP基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成6條引物，建立了SIV的LAMP檢測(cè)方法，并進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該方法可特異性檢測(cè)H1N1、H1N2、H3N2、類禽H1N1亞型SIV及甲型H1N1流感病毒，但不能檢測(cè)出豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、日本乙型腦炎病毒，該方法的最低檢測(cè)量為100拷貝/μL質(zhì)粒DNA。

3 小結(jié)與展望

SI是一種世界性的豬的呼吸道傳染病，在豬場(chǎng)內(nèi)廣泛存在，是規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的常發(fā)病，并呈現(xiàn)地方流行性，單純感染SIV后，豬死亡率并不高，但SI是一種免疫抑制性疾病，容易導(dǎo)致其他病原繼發(fā)感染，造成豬大量死亡。SIV能感染人，威脅人的生命安全，因此，平時(shí)要加強(qiáng)豬飼養(yǎng)管理和日常衛(wèi)生消毒工作，降低飼養(yǎng)密度，增強(qiáng)豬的抵抗力，控制好豬只和人員進(jìn)出，防止疫病的傳入，可以定期免疫現(xiàn)有滅活疫苗，有條件的豬場(chǎng)也可分離出相應(yīng)毒株，委托一些生物制品企業(yè)生產(chǎn)自家苗。對(duì)已發(fā)生豬流感的豬場(chǎng)，對(duì)全群豬緊急免疫接種滅活疫苗，并肌注抗生素，避免其他細(xì)菌病的繼發(fā)感染，隔離病豬，保證病豬的休息和營(yíng)養(yǎng)，加強(qiáng)管理，防止病毒傳播。一旦發(fā)現(xiàn)豬疑似感染豬流感，一定要做好個(gè)人防護(hù)工作，盡量佩戴口罩、手套、帽子，接觸后洗手、洗澡，避免感染SIV。

SI及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)其防控意義重大，目前SI的血清學(xué)檢測(cè)方法主要有HI和ELISA，但這些方法不能區(qū)分是疫苗毒還是野毒產(chǎn)生的抗體，而病原檢測(cè)中病原分離、鑒定的檢測(cè)方法雖然準(zhǔn)確、可靠，但耗時(shí)太長(zhǎng)，滿足不了臨床快速確診的需求，因此，需要采用近幾年發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，雖然目前已經(jīng)建立了多種分子診斷方法，在臨床SI的診斷中起到了一定作用，但這些方法都有利有弊，如常規(guī)RT-PCR方法敏感性不夠高，可能造成漏檢，且不能實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的定量檢測(cè)，熒光定量RT-PCR方法可彌補(bǔ)常規(guī)RT-PCR的缺點(diǎn)，但對(duì)人員和設(shè)備儀器要求太高，基層人員不易掌握儀器的操作使用和結(jié)果的分析，需要儀器和耗材的維持運(yùn)作費(fèi)用較高，不適合獸醫(yī)基層單位大規(guī)模推廣和應(yīng)用。LAMP方法檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便，適合在基層獸醫(yī)和養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行推廣使用，但容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，上述檢測(cè)試劑的核酸檢測(cè)試劑均需要冷凍保存，成本高昂且運(yùn)輸半徑極其受限，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，目前對(duì)其他疾病的檢測(cè)方面已經(jīng)研制出了基因試紙卡檢測(cè)盒，具有LAMP檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)，又能避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，操作簡(jiǎn)單，全程時(shí)間短，最重要的是檢測(cè)試劑不需要冷凍保存，易保存和運(yùn)輸，適合基層獸醫(yī)部門應(yīng)用，筆者認(rèn)為基因試紙卡及其配套適合攜帶的簡(jiǎn)易核酸制備設(shè)備是未來(lái)SIV檢測(cè)試劑的研究方向。

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2016-05-10）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-022-15) ，山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2013CQ006)，山東省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（ZR2014CQ010）

于新友(1983-)，男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷技術(shù)研究