王　瑋，王曉雪，李朋梅，張相林

(衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院藥學(xué)部，北京　100029)

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基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的臨床代謝組學(xué)中樣本前處理方法的研究進(jìn)展Δ

王瑋*，王曉雪，李朋梅，張相林#

(衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院藥學(xué)部，北京100029)

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后的新興“組學(xué)”研究方法，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[1]。作為一門研究生物體內(nèi)源性代謝物整體及其變化規(guī)律的科學(xué)，代謝組學(xué)以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)，對某一生物或細(xì)胞在特定生理時期內(nèi)所有低分子量(<1 000 Da)代謝物同時進(jìn)行定性和定量分析，具有較好的預(yù)見性和可靠性，可準(zhǔn)確、有效地判定不良反應(yīng)程度，是尋找新型可靠生物標(biāo)記物的重要手段，在疾病的早期發(fā)現(xiàn)、機(jī)制研究以及藥物安全性評價等方面發(fā)揮著重要作用[2-5]。臨床代謝組學(xué)研究的樣本包括生物液體和組織，由于尿液和血液收集簡單、易于長期檢測及包含大量的代謝信息，已成為代謝組學(xué)研究的常用標(biāo)本。對樣本進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚恚箼z測的準(zhǔn)確度、精密度、重現(xiàn)性等符合要求，是研究的基礎(chǔ)。代謝組學(xué)的研究對象是生理、病理過程中的代謝產(chǎn)物，盡可能多地減少代謝產(chǎn)物的損失、獲得更多的代謝產(chǎn)物是前處理的目標(biāo)，同時，需兼顧方法重現(xiàn)性好、前處理步驟少、節(jié)約處理時間、盡量減少引起變異因素等。根據(jù)研究對象、研究目的等的不同，前處理具體步驟也不同。因此，做好生物樣本的前處理是臨床代謝組學(xué)研究的重要前提。初期，代謝組學(xué)研究主要采用核磁共振波譜法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)、質(zhì)譜法(mass spectrometry，MS)為核心的分析技術(shù)。近年來，不同類型串聯(lián)質(zhì)譜儀不斷發(fā)展，其不僅可以實(shí)現(xiàn)高通量分析，還可同時獲得分子離子和子離子的精確質(zhì)量數(shù)，有利于獲取分子式及代謝物的裂解特征信息、有效進(jìn)行未知化合物的解析，因此非常適合尋找及鑒定標(biāo)志物。由于其獨(dú)特的研究角度和技術(shù)優(yōu)勢，MS已超過NMR成為應(yīng)用最廣泛的代謝組學(xué)工具，并迅速應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)及生物學(xué)的各個研究領(lǐng)域，取得了巨大的成就[6-9]。本文對基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)的臨床代謝組學(xué)研究中生物樣本前處理方法進(jìn)行綜述。

1　尿液前處理方法

尿液中主要含有極性的低分子量代謝物，包括羧酸類、有機(jī)胺類、氨基酸類等，同時含有少量細(xì)胞、微量大分子物質(zhì)以及磷酸鹽、硫酸鹽等各種鹽類。尿液的前處理方法較其他體液相對簡單，但其所含物質(zhì)的極性、pH、滲透壓等有較大差異，尤其機(jī)體處于壓力狀態(tài)時尿液中多種成分的差異性更大，這對尿液的前處理又帶來一定的難度[2]。目前，尿液的前處理多采用離心后稀釋的方法。首先將尿液離心后，用純水或有機(jī)試劑以1 ∶1～1 ∶3的體積比進(jìn)行稀釋，隨后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶或96孔板中，處理好的樣本于0～4 ℃條件下儲存待測。Guy等[10]的研究中，將收集到的尿液標(biāo)本分裝在1.5 ml EP管中，在-80 ℃下儲存?zhèn)溆谩z測前將樣本在室溫(25 ℃)下融化，精密量取25 μl，加入75 μl蒸餾水(高效液相色譜/MS級)稀釋，稀釋后的樣本裝入進(jìn)樣瓶，待測。Li等[11]曾報道，將800 μl乙腈加入800 μl尿液標(biāo)本中，渦旋1 min混勻，13 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取1 400 μl上清液揮干，用70%的乙腈200 μl復(fù)溶，渦旋1 min，4 ℃、13 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液進(jìn)樣等。這種將尿液稀釋后進(jìn)樣的前處理方法，可減少尿液基質(zhì)對LC-MS/MS分析測定的影響，最大限度減少分析物的丟失[12-13]，且簡便易行。但是，稀釋可能造成信號強(qiáng)度降低，使部分含量較低的代謝物可能無法被檢測[14]。另外，也可通過分子過濾器除去尿液中微粒及少量蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行前處理，如將1 ml尿液標(biāo)本在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取300 μl上清液，加入600 μl甲醇，渦旋10 min混勻，然后在4 ℃、14 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取800 μl上清液經(jīng)0.45 μm過濾器濾過后，低溫保存待測[15]。這種處理方法可有效降低污染的風(fēng)險，但處理成本稍高。此外，還有文獻(xiàn)報道可將尿液冷凍干燥后用甲醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取[16]，該方法重現(xiàn)性較好，但可能會造成尿液中揮發(fā)性成分的丟失，改變尿液的特征代謝指紋譜[17]。

2　血液前處理方法

血液是代謝組學(xué)研究中重要的體液樣本，其成分較尿液更為復(fù)雜。血液樣本類型包括血清、血漿和全血。血清和血漿中所含成分種類繁多，極性跨度很大，同時含有大量的蛋白質(zhì)。因此，應(yīng)用LC-MS/MS進(jìn)行分析前需去除蛋白，前處理方法需兼顧不同極性代謝物的性質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)多種代謝物的高通量監(jiān)測。

2.1非靶向代謝組學(xué)

目前，非靶向代謝組學(xué)研究中血液樣本前處理常用方法為有機(jī)溶劑沉淀法，多采用甲醇或乙腈作為蛋白沉淀劑處理血樣。如Zhu等[18]曾報道，在50 μl血清中加入150 μl甲醇，渦旋2 min，-20 ℃下靜置20 min，然后將樣本在14 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中；加入300 μl甲醇于下層沉淀，渦旋10 min，14 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min；取上清液，與上次萃取的上清合并，將合并的萃取液揮干后，用500 μl乙腈-水(V∶V=60 ∶40，5 mmol/L醋酸銨，0.2%乙酸)復(fù)溶后進(jìn)樣。該方法對樣本進(jìn)行2次萃取，代謝物提取比較完全，但步驟較為繁瑣，如果進(jìn)行大批量樣本前處理，則樣品的均一性難以得到有效保證。目前，通用前處理方法是有機(jī)溶劑沉淀蛋白1次。通常向待測的血漿或血清樣本中加入3倍體積的冰凍甲醇或乙腈，渦旋，12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min除去沉淀的蛋白；將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，揮干后用水-乙腈混合溶液(V∶V=95 ∶5)復(fù)溶；渦旋，12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶或96孔板等，將進(jìn)樣瓶等放入0～4 ℃自動進(jìn)樣器中進(jìn)樣分析[19-20]。另外，也有研究對樣本沉淀蛋白后直接進(jìn)樣。具體處理為：100 μl血清樣本中加入300 μl冰甲醇，渦旋30 s；4 ℃、14 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析[21]。該方法減少了濃縮步驟，操作較通用的方法更簡單，但由于對樣品進(jìn)行了稀釋，導(dǎo)致低含量代謝物有可能檢測不到，所以對儀器靈敏度要求較高。以往文獻(xiàn)中多采用甲醇或乙腈與待測血樣3∶1的體積比進(jìn)行蛋白沉淀，且采用冰凍的有機(jī)試劑或加入有機(jī)試劑后在-20 ℃下孵育一定時間進(jìn)行前處理，可優(yōu)化前處理方法。同時，也有文獻(xiàn)采用有機(jī)試劑與血樣4 ∶1的體積比進(jìn)行前處理，如Luo等[22]曾報道，將100 μl血清中加入400 μl乙腈(含內(nèi)標(biāo))，渦旋60 s，4 ℃、14 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取200 μl上清液轉(zhuǎn)移至EP管中揮干，用50 μl乙腈-水溶液(V∶V=1 ∶4)復(fù)溶，取上清液進(jìn)樣分析。此外，也有文獻(xiàn)報道使用異丙醇作為沉淀劑，如50 μl血漿中加入150 μl冰凍異丙醇，室溫(25 ℃)下孵育10 min，-20 ℃下過夜，然后在4 ℃、14 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，取100 μl上清液進(jìn)樣[23]。常用于化合物純化、去除蛋白的固相萃取法，似乎并不太適合代謝組學(xué)的樣本前處理。有研究通過考察不同有機(jī)溶劑沉淀蛋白和固相萃取技術(shù)對血漿中蛋白質(zhì)的去除程度以及對待測物的提取效果，發(fā)現(xiàn)前者的提取效率和沉淀蛋白效果較好[24]。

2.2靶向脂質(zhì)組學(xué)

在靶向脂質(zhì)組學(xué)研究中，脂質(zhì)類成分提取的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法是采用三氯甲烷(CHCl3)-甲醇(V∶V=2∶1)混合溶劑進(jìn)行提取[25]，也有報道采用二氯甲烷(CH2Cl2)-甲醇提取法[26]或甲基叔丁基醚(MTBE)-甲醇提取法[27]。習(xí)聰?shù)萚28]比較了CHCl3-甲醇(V∶V=2 ∶1)、CH2Cl2-甲醇(V∶V=2 ∶1)、MTBE-甲醇(V∶V=4 ∶1)3種混合溶劑作為提取溶劑時血清樣本脂質(zhì)類成分的提取效果，結(jié)果顯示，CH2Cl2-甲醇的提取效果最佳，且CH2Cl2的毒性遠(yuǎn)小于CHCl3，采用CH2Cl2-甲醇作為提取劑的安全性較高。具體處理步驟如下：血清樣本于4 ℃下解凍，取血清30 μl加入CH2Cl2-甲醇(V∶V=2 ∶1)(含0.1 g/L 2,6-二叔丁基-4-甲基酚，0 ℃)混合溶劑600 μl中，渦旋并靜置，加入水200 μl，離心后取有機(jī)相氮?dú)獯蹈?，加入乙?異丙醇(V∶V=1 ∶1)混合溶劑500 μl，復(fù)溶，10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后，取上清液進(jìn)樣。

3　組織前處理方法

不同組織器官的前處理方法各有不同。肝臟組織前處理可采用以下方法：取5 g左右肝臟組織，加入300 μl冰甲醇-水(V∶V=4 ∶1)混合溶液，混勻后放入組織勻漿儀中，將樣本在冰上靜置20 min，4 ℃下渦旋(轉(zhuǎn)速為14 000 r/m)10 min，對上清液進(jìn)樣分析[21]。骨組織前處理可將冷凍在液氮中的骨組織取出，稱取50 mg，用組織研磨機(jī)研磨，然后依次加入400 μl乙酸乙酯-乙醇混合液(V∶V=1 ∶1)、200 μl無水甲醇、200 μl無水甲醇-水(V∶V=3 ∶1)混合液、200 μl CH2Cl2-甲醇(V∶V=3 ∶1)混合液，其中每加入1種溶液后在研磨機(jī)中振搖2 min，12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液，然后將多次萃取的上清液混勻，用氮?dú)獯蹈?，?00 μl甲醇-超純水(V∶V=4 ∶1)混合液復(fù)溶，渦旋2 min，超聲10 min，12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后，取上清液進(jìn)樣[29]。

總之，臨床生物樣本所含化合物種類繁多、極性跨度大，既有高極性的氨基酸、核苷酸類、葡萄糖等，也有低極性的脂類、膽固醇類等成分。在分析前不僅需要除去基質(zhì)以減少對色譜柱和質(zhì)譜儀的干擾、污染，同時還要保證代謝物的全面、無差別、高通量的提取。如同一種分析檢測平臺不能夠完全滿足代謝組檢測的要求，對生物樣本的前處理單靠一種方法也往往難以實(shí)現(xiàn)全覆蓋、快速分析的要求，在尋找代謝標(biāo)志物的研究中更是如此。目前，臨床代謝組學(xué)的樣本前處理研究缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。本文也僅是對通用前處理方法進(jìn)行了總結(jié)。但是，相信隨著前處理技術(shù)的不斷創(chuàng)新，前處理?xiàng)l件的不斷優(yōu)化以及標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范的逐步建立，生物樣本的前處理會更簡便、全面、高效。

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2016-06-17)

國家自然科學(xué)青年基金(No.81503175)；北京市自然科學(xué)青年基金(No.7154237)；中日友好醫(yī)院青年基金(No.2014-3-QN-27)

主任藥師，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：個體化給藥與臨床藥理學(xué)。E-mail：zryhyyzxl@126.com

R969.1

A

1672-2124(2016)07-0868-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.07.002

*藥師，碩士。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：67671218@qq.com