基金項目:深圳市龍崗區(qū)科技創(chuàng)新局資助項目(深龍科2014-52號)。

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血清中艱難梭菌毒素A&B檢測在腹瀉診斷中的應用*

*基金項目:深圳市龍崗區(qū)科技創(chuàng)新局資助項目(深龍科2014-52號)。

陳日炳，李小峰△，胡琴，李志祥

(深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 517200)

摘要:目的調(diào)查深圳東部地區(qū)住院腹瀉患者艱難梭菌感染情況，并評價3種艱難梭菌檢測方法的靈敏度和特異度。方法收集深圳東部地區(qū)2014年1月至2015年4月住院腹瀉患者的糞便和血清標本各253份，同時進行糞便標本培養(yǎng)鑒定，酶聯(lián)免疫熒光法檢測糞便和血清標本中艱難梭菌毒素A&B水平，對鑒定及檢測結(jié)果結(jié)合臨床資料進行分析。結(jié)果糞便培養(yǎng)(48 h)檢出艱難梭菌10例(3.95%)，糞便中檢測到艱難梭菌毒素A&B 15例(5.93%)；血清中檢測到艱難梭菌毒素A&B 14例(5.53%)。結(jié)論檢測血清中艱難梭菌毒素A&B對診治艱難梭菌感染腹瀉的患者有重要意義。

關鍵詞:艱難梭菌；糞便；血清；腹瀉

艱難梭菌是一種革蘭陽性專性厭氧芽孢桿菌，在正常情況下，該細菌受制于人體其他細菌，不會產(chǎn)生危害[1]。但過度應用抗菌藥物、免疫抑制劑或化療藥物可使耐藥的艱難梭菌產(chǎn)毒株過度繁殖并釋放艱難梭菌毒素A&B導致艱難梭菌相關性腹瀉，這對兒童和老年人可能是致命的[2]。隨著艱難梭菌相關性腹瀉的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增加，甚至在北美地區(qū)多家醫(yī)院內(nèi)爆發(fā)流行，引起了世界范圍的關注，而預防艱難梭菌感染也成為醫(yī)院感染控制的新挑戰(zhàn)。細菌培養(yǎng)及鑒定作為艱難梭菌感染的傳統(tǒng)方法，主要是將大便接種至艱難梭菌選擇性培養(yǎng)基，并在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h。對培養(yǎng)后可疑菌落再行鑒定。該方法雖然較為經(jīng)典但由于所需周期較長，易延誤治療。而酶聯(lián)免疫熒光法艱難梭菌毒素A&B檢測技術采用酶免夾心法與終點免疫熒光相結(jié)合，通常以糞便標本檢測為主，可準確預測患者體內(nèi)菌群致病性，但仍然存在標本采集的局限性[3]，因此本文創(chuàng)新性地提出檢測血清中艱難梭菌毒素A&B的方法。為了解本地區(qū)住院腹瀉患者艱難梭菌感染情況，并評價3種艱難梭菌檢測方法靈敏度和特異度，對深圳東部地區(qū)三家大型醫(yī)院住院腹瀉患者的的糞便和血清進行艱難梭菌毒素檢測，結(jié)合細菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果進行綜合分析，為臨床艱難梭菌感染的治療和控制提供參考，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2014年1月至2015年4月入住深圳東部地區(qū)人民醫(yī)院、中心醫(yī)院、中醫(yī)院發(fā)生腹瀉的住院患者253例象，納入標準：根據(jù)原衛(wèi)生部《醫(yī)院感染診斷標準》住院時間大于3 d，出現(xiàn)腹瀉癥狀1 d在3次以上；1個月內(nèi)使用過抗菌藥物，如氟喹諾酮類、頭孢菌素或B-內(nèi)酰胺類抗菌藥物等；長期使用胃酸抑制劑，如質(zhì)子泵抑制劑、H2受體阻滯劑等。無明顯抗菌藥物暴露史，但臨床高度懷疑艱難梭菌感染者。排除食物中毒、脂肪瀉、病毒性腹瀉、菌痢、沙門菌屬腹瀉及慢性腹瀉疾病患者[4]。研究對象來源及特征見表1。

1.2儀器與試劑法國梅里埃全自動細菌鑒定儀、螢光酶標儀；荷蘭微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)；日本SANYO-CO2培養(yǎng)箱。艱難梭菌產(chǎn)色培養(yǎng)基、厭氧袋和艱難梭菌毒素檢測試劑盒均為法國梅里埃產(chǎn)品。

1.3檢測方法

1.3.1標本采集所有符合納入標準的研究對象，每人收集糞便5 mL，均分于2個干凈無防腐劑的大便標本無菌杯中，立即送檢，同時用生化管采集患者外周全血5 mL，3 000 g離心5 min分離血清，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2糞便標本艱難梭菌培養(yǎng)及鑒定一份糞便標本及時接種于艱難梭菌產(chǎn)色培養(yǎng)基,立即置厭氧箱中厭氧環(huán)境培養(yǎng)24 h，觀察有無艱難梭菌典型菌落生長(黑色菌落)。若沒有典型菌落，可延遲放置48 h再觀察。取可疑菌落進行鑒定。

1.3.3糞便標本直接檢測艱難梭菌毒素A&B吸取200 μL充分混勻的液體糞便，加入到干凈離心管中，加入1 mL標本稀釋液(R1),渦旋混勻，12 000 g離心5 min，取300 μL上清液待測。具體操作步驟及結(jié)果判斷嚴格按照試劑盒說明書

1.3.4血清標本直接檢測艱難梭菌毒素A&B取200 μL待測血清，加入1 mL標本稀釋液(R1),渦旋混勻，12 000 g離心5 min，取300 μL上清液待測。具體操作步驟及結(jié)果判斷嚴格按照試劑盒說明書。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1　　研究對象來源及特征(n)

2結(jié)果

糞便培養(yǎng)出艱難梭菌10例(3.95%)，糞便中檢測到艱難梭菌毒素A&B 15例(5.93%)；血清中檢測到艱難梭菌毒素A&B 14例(5.53%)。與糞便培養(yǎng)鑒定相比，糞便毒素檢測和血清毒素檢測陽性率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而糞便毒素檢測和血清毒素檢測陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各種方法優(yōu)缺點見表3。

表2　　各種方法檢測陽性率比較

*：PZ<0.05，與糞便培養(yǎng)法比較。

表3　　各種方法優(yōu)缺點比較

3討論

近年來隨著抗菌藥物濫用加劇，加之免疫抑制劑和化療藥物應用增多，國內(nèi)外耐藥性艱難梭菌感染的發(fā)生率呈明顯上升趨勢。僅在美國，每年艱難梭菌感染者就超過了40萬例，且感染的病死率高達10%[5]。上海市疾病預防控制中心(CDC)的調(diào)查表明，由上海市各大醫(yī)院艱難梭菌感染引起的腹瀉高達7.1%[6]，提示我國艱難梭菌感染形勢也很嚴峻，因此選用合適的檢測方法，及時準確地對艱難梭菌感染進行診斷，以及有針對性地用藥對該病預后尤為重要。因此本研究采用糞便培養(yǎng)鑒定、糞便中A&B毒素檢測和血清中A&B毒素檢測3種方法，在調(diào)查本地區(qū)住院腹瀉患者艱難梭菌感染情況的同時，比較3種方法的可行性。

本研究結(jié)果顯示，糞便培養(yǎng)鑒定法的陽性率較低(3.95%)，這可能與厭氧菌對標本采集運送條件嚴苛有關，糞便中優(yōu)勢菌群如腸桿菌等，也會抑制艱難梭菌的生長，進而影響檢測結(jié)果[7]。同時培養(yǎng)法作為檢驗艱難梭菌的傳統(tǒng)方法，培養(yǎng)條件苛刻，對實驗設備要求較高，檢測周期長，加之成本昂貴，無法確定與腹瀉的因果關系，因此該方法已不能滿足當前臨床診治需要。與培養(yǎng)鑒定法相比，用糞便標本檢測A&B毒素，陽性率明顯升高(5.93%)，選用商品化試劑盒，檢測快速，且結(jié)果穩(wěn)定性較好，易于標準化，目前被視為先進方法[8]。但也存在糞便取樣受限，不能做到隨取隨做的缺點。因此本研究中嘗試用血清代替糞便進行艱難梭菌毒素檢測，結(jié)果表明糞便毒素檢測和血清毒素檢測陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且血樣抽取受限較少，在患者失去意識、消化系統(tǒng)手術后等無法順利收集糞便標本的特殊情況下，該法具有明顯優(yōu)勢。但該方法能否廣泛應用仍需大量樣本研究驗證。

本文研究表明深圳東部地區(qū)住院腹瀉患者中檢出艱難梭菌A&B毒素的陽性率為5.93%，低于高燕婷等人的研究[9]，這可能與該地區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生部門良好的抗菌藥物使用習慣有關；感染者多為老年人和兒童，可能與個體的抵抗力有關。

綜上所述，針對特定人群檢測血清中艱難梭菌毒素A&B，對艱難梭菌診治有重要意義。但做好院內(nèi)感染的防治，降低院內(nèi)感染的發(fā)生,同時嚴格規(guī)范抗菌藥物的使用[10]，保持環(huán)境衛(wèi)生及維持腸道內(nèi)微生抵穩(wěn)態(tài)才能從根本上降低艱難梭菌發(fā)病率和病死率。

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·臨床研究·

收稿日期：(2015-08-18)

文獻標識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.062A

文章編號：1673-4130(2015)24-3641-03

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