章梁君，鐘錦莎，鐘輝秀，劉偉平，殷明剛，楊新春

(1.自貢市第一人民醫(yī)院檢驗科，四川自貢 643000;2.成都中醫(yī)藥大學，四川成都 610072)

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惡性腫瘤患者外周血淋巴細胞免疫表型檢測的臨床意義

章梁君1，鐘錦莎2，鐘輝秀1，劉偉平1，殷明剛1，楊新春1

(1.自貢市第一人民醫(yī)院檢驗科，四川自貢 643000;2.成都中醫(yī)藥大學，四川成都 610072)

摘要:目的研究惡性腫瘤患者外周血淋巴細胞免疫表型變化及其臨床意義。方法采用流式細胞術檢測167例惡性腫瘤患者組(包括呼吸道癌、胃腸道癌、生殖系統(tǒng)癌)外周血中T淋巴細胞亞群、CD19+B細胞、CD3-CD56+自然殺傷細胞(NK)細胞、CD3+CD56+自然殺傷T細胞(NKT)細胞免疫表達水平，設170例健康對照組進行對比分析，并根據(jù)有無腫瘤轉移和化療周期進行分析。結果惡性腫瘤患者總淋巴細胞絕對值,CD3+CD4+比例明顯低于健康對照組(P<0.05),而CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD56+比例卻明顯高于健康對照組(P<0.05)。腫瘤轉移患者組CD3+CD4+比例明顯低于未發(fā)生腫瘤轉移患者組(P=0.011)，而CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD3+CD56+比例明顯高于未發(fā)生腫瘤轉移患者組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在化療治療中，CD3+CD4+、CD3+CD56+、CD3-CD56+比例隨著化療周期增加而逐漸增高，而CD3+CD8+比例呈逐漸降低。結論在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中，細胞免疫功能起主導地位，可作為臨床監(jiān)測腫瘤患者細胞免疫功能狀態(tài)的指標之一。

關鍵詞:輔助性T淋巴細胞；細胞毒性T淋巴細胞；自然殺傷細胞；自然殺傷T細胞

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)密切相關。腫瘤患者通常伴有免疫抑制或損傷,腫瘤免疫的效應機制主要是通過細胞免疫反應發(fā)揮作用。因此，檢測患者細胞免疫功能指標有助于判斷病情和指導治療，目前已有研究表明T淋巴細胞亞群在惡性腫瘤進展和轉移中起著重要的作用[1]，但淋巴細胞所有亞型在整個腫瘤疾病過程中的變化情況，目前國內外報道較少，因此，本研究采用流式細胞術通過檢測167例腫瘤患者和170例健康對照者外周血CD3+CD4+輔助性T淋巴細胞(Th)、CD3+CD8+細胞毒性T淋巴細胞(Tc)、CD19+B淋巴細胞、CD3-CD56+自然殺傷細胞(NK)、CD3+CD56+自然殺傷T細胞(NKT)在淋巴細胞中所占比例，來探討細胞免疫功能變化與病情發(fā)展的關系。

1資料與方法

1.1一般資料標本取自本院腫瘤科2014年4月至2015年4月的167例惡性腫瘤患者(其中發(fā)生腫瘤轉移90例，未發(fā)生腫瘤轉移77例，按腫瘤發(fā)生部位分為呼吸系統(tǒng)癌74例，胃腸系統(tǒng)癌46例，生殖系統(tǒng)癌25例)的外周血，全部病例均經(jīng)病理證實。其中男92例，女75例，平均(58.67±10.61)歲。健康對照組170名，為本院進行體檢的人員，其中男101例，女69例，平均(60.75±15.37)歲。各患者組與對照組在年齡、性別等構成方面的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

1.2方法所有觀察者對象抽取空腹靜脈血2 mL置于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，取CD3、CD4、CD8、CD56、CD19熒光標記的單克隆抗體(Beckman,美國)各20 μL,分別加入100 μL抗凝的外周血,室溫暗處反應15 min,然后用細胞裂解液(Beckman,美國)溶解紅細胞,PBS 洗細胞一次,流式細胞儀(美國Beckman-Coulter，EPICS0-XL)測定T淋巴細胞亞群、B淋巴細胞和NK淋巴細胞(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD56+、CD3+CD56+),在直方圖中框出淋巴細胞群,再分別計數(shù)5 000個淋巴細胞中各標記細胞在淋巴細胞中的百分率。

表1　　一般資料比較

2結果

2.1健康組和惡性腫瘤組淋巴細胞免疫表型檢測結果比較惡性腫瘤患者組總淋巴細胞絕對值、CD3+和CD3+CD4+比例明顯低于健康對照組(P<0.05),CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD56+比例明顯高于健康對照組(P<0.05)。惡性腫瘤患者外周血中CD3-CD19+比例略低于健康對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

進一步按照腫瘤發(fā)生部位不同，分為呼吸道癌、胃腸道癌、生殖系統(tǒng)癌三組，結果顯示，三組癌癥與健康對照組相比總淋巴細胞絕對值、CD3+和 CD3+CD4+比例明顯低于健康對照組,而CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD56+比例明顯高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.2未發(fā)生腫瘤轉移和發(fā)生腫瘤轉移患者淋巴細胞免疫表型檢測結果的比較167例腫瘤患者中未發(fā)生腫瘤轉移患者90例，發(fā)生腫瘤轉移患者77例，結果顯示，發(fā)生腫瘤轉移患者組其CD3+CD4+比例明顯低于未發(fā)生腫瘤轉移患者組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.011)，而CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD3+CD56+比例明顯高于未發(fā)生腫瘤轉移患者組，差異有統(tǒng)計學意義(P分別為0.029、0.012和0.004)；而其他指標總T淋巴細胞、CD3-CD19+在淋巴細胞所占比例在腫瘤有無發(fā)生轉移患者間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

2.3不同化療周期惡性腫瘤患者外周血淋巴細胞免疫表型測定結果比較不同惡性腫瘤患者按照不同的病種、病期、患者的一般情況等因素決定化療周期數(shù)，167例腫瘤患者中未化療患者組42例，化療1～3周期患者32例，化療4～6周期患者73例，化療后大于6周19例，結果顯示，CD3+CD4+比例在未化療患者中比例最低為(28.64±14.29)%，隨著化療周期增加而逐漸增高，化療大于6周后患者與健康對照相比均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；CD3+CD8+比例在化療1～3周期患者中比例最高為(34.14±14.27)%，且隨著化療周期的增加其比例逐漸降低，同樣的，化療大于6周后患者與健康對照相比均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。在患者外周血CD3+CD56+含量中，化療周期間比例明顯高于健康對照組(P<0.05)，且呈逐漸增高趨勢，大于6周期患者的比例最高為(6.85±3.67)%；同樣的，CD3-CD56+含量隨著化療周期增加而逐漸增加，大于6周期患者的比例最高為(18.89±9.55)%，見表5(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

表4　　未腫瘤轉移和腫瘤轉移患者淋巴細胞免疫

3討論

細胞免疫功能狀態(tài)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中對病情發(fā)展變化和預后起著重要的作用，而目前利用患者細胞免疫功能狀態(tài)而進行抗腫瘤細胞免疫治療技術已越來越多的應用于臨床[2-3]，因此，對惡性腫瘤患者細胞免疫功能的正確評價和判斷顯得尤為重要。在抗腫瘤反應過程中細胞免疫是以T淋巴細胞為主，CD3+細胞代表為成熟淋巴細胞，也是細胞免疫中主要活性細胞，CD3+CD4+細胞代表為輔助性T淋巴細胞，它能分泌細胞因子從而活化單核細胞、巨噬細胞和 NK細胞，增強吞噬細胞的抗感染能力進而發(fā)揮抗腫瘤功能，對細胞免疫起正調節(jié)作用，CD3+CD8+細胞代表為抑制性T淋巴細胞，不僅對靶細胞具有一定殺傷作用，而且能抑制機體免疫應答，對細胞免疫起負調節(jié)作用,CD3+CD4細胞和CD3+CD8+細胞在正常情況下處于動態(tài)平衡狀態(tài)。目前T淋巴細胞亞群的檢測研究已見于多種疾病，如自身免疫性疾病、肝臟疾病、血液系統(tǒng)疾病、心血管疾病等[4-5]，本研究結果發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者包括呼吸道癌組、胃腸道癌組和生殖系統(tǒng)癌組，與健康對照組相比總淋巴細胞絕對值、CD3+、CD3+CD4+比例明顯降低,而CD3+CD8+比例較健康對照組高，即CD3+CD4+/CD3+CD8+降低，說明腫瘤患者的細胞免疫功能處于免疫抑制狀態(tài)，機體對識別和殺傷突變細胞的能力下降，造成機體免疫功能失衡。已有研究發(fā)現(xiàn)主要是由于腫瘤細胞微環(huán)境中存在許多免疫抑制因子能抑制CD3+CD4+細胞的成熟和分化，同時CD3+CD8+細胞顯著增多，從而使患者處于免疫抑制狀態(tài)[6]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)在未發(fā)生腫瘤轉移組CD3+CD4+比例明顯高于發(fā)生腫瘤轉移組，且CD4+CD8+比例明顯低于發(fā)生腫瘤轉移組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示了患者細胞免疫功能越受抑制，腫瘤細胞生長速度越猛，擴散越快，從而出現(xiàn)轉移。以上結果與國內許多研究結果基本一致[7-8]。因此，腫瘤患者動態(tài)監(jiān)測T淋巴細胞亞群對腫瘤有無發(fā)生轉移有一定的指導意義。本研究另一項結果顯示，CD3-CD19+比例在惡性腫瘤組和健康對照組間無統(tǒng)計學差異，說明體液免疫中發(fā)揮巨大作用的B淋巴細胞(主要以CD3-CD19+為主)在惡性腫瘤疾病中變化較小，再次證明了細胞免疫在腫瘤疾病中的重要地位。

外周血中NK細胞是具有天然殺傷某些腫瘤細胞、病毒感染細胞等能力的淋巴細胞，而NKT細胞是一類共同表達NK細胞和T淋巴細胞表面標志物的細胞，該細胞是在IL-2、IL-7等多種細胞因子的誘導下產(chǎn)生，主要發(fā)揮細胞溶解效應[9]?，F(xiàn)階段國內外已有許多研究表明NK和NKT細胞在自身免疫性疾病、病毒感染疾病、炎癥疾病及腫瘤疾病均發(fā)揮重要的作用[10-11]。本研究結果表明腫瘤患者組外周血中的CD3-CD56+細胞、CD3+CD56+細胞比例與健康對照組相比均明顯升高，反映了機體在抗腫瘤的免疫反應增強，提示惡性腫瘤患者體內的細胞免疫功能有促進激活NK和NKT細胞增殖現(xiàn)象。本研究進一步研究發(fā)現(xiàn)，在未發(fā)生腫瘤轉移組CD3+CD56+、CD3-CD56+比例明顯低于發(fā)生腫瘤轉移組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示在腫瘤細胞進一步擴散中NKT和NK細胞的抗腫瘤作用進一步增強。研究發(fā)現(xiàn)，NK和NKT細胞在抗腫瘤免疫中起著相互相成作用，它們不僅能直接殺傷腫瘤細胞，NKT細胞還能通過產(chǎn)生IL-2等細胞因子進一步激活NK細胞，從而使NK細胞進一步得到活化并提高其細胞毒活性，發(fā)揮著擴大免疫效應和抗腫瘤免疫功能[12]。因此，監(jiān)測NK和NKT細胞比例對腫瘤患者抗腫瘤能力檢測具有重要的價值。

化療是目前治療腫瘤的常用手段之一，它可明顯提高患者生存率和總生存時間，有研究表明，化療療法對機體的免疫功能同時具有促進和抑制的兩面性作用[13]，其主要的機制為腫瘤化療藥物在殺傷癌細胞的同時，也必然對健康免疫細胞造成一定的傷害，但同時在腫瘤細胞大量減少的情況下，必然減少腫瘤細胞所釋放的抑制因子，降低免疫抑制功能，從而使免疫功能得以恢復，因此，化療中腫瘤患者的細胞免疫功能研究是目前研究的熱點之一。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著化療周期的增加，惡性腫瘤患者的CD3+CD4+細胞比例逐漸增加，而CD3+CD8+細胞比例呈逐漸減少趨勢，且大于6周期化療的患者與健康對照組相比，CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明隨著化療的進展惡性腫瘤患者的免疫功能狀態(tài)逐漸恢復健康，由免疫抑制狀態(tài)逐漸減弱，且患者的抵抗力在逐漸恢復中，且大于6周期化療患者免疫功能已基本恢復健康。同樣，CD3+CD56+、CD3-CD56+細胞比例隨著化療周期增加而逐漸增高，說明機體在免疫功能恢復的過程中，抗腫瘤能力在逐漸增強。由此可以得出，化療會對機體細胞造成損傷，會抑制機體的免疫，但其在抑制免疫的同時又有免疫平衡的恢復和免疫功能的增強，且隨著化療周期的增加，化療促進免疫的占據(jù)優(yōu)勢。

綜上所述，細胞免疫功能在惡性腫瘤患者的發(fā)生、發(fā)展及治療中起著重要的作用，主要表現(xiàn)在CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+和CD3+CD56+細胞比例的變化，它們互相促進或者抑制，對患者機體免疫功能的失衡和抗腫瘤免疫起著重要的作用，這些指標可作為臨床監(jiān)視腫瘤免疫狀態(tài)的重要指標之一，值得推廣。

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·論著·

Clinical significance of detecting peripheral blood lymphocyte immunophenotype in patients with malignant carcinoma

ZhangLiangjun1,ZhongJinsha2,ZhongHuixiu1,LiuWeiping1,YinMinggang1,YangXinchun1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ZigongMunicipalFirstPeople′sHospital,Zigong,Sichuan643000,China;

2.ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610072,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the change of peripheral blood lymphocyte immunophenotype in the patients with malignant carcinoma and its clinical significance.MethodsThe flow cytometry was adopted to detect the expression levels of peripheral blood T lymphocyte subpopulations,CD19+cells,CD3-CD56+cells,CD3+CD56+cells in 167 patients with malignant carcinoma (including respiratory tract cancers,gastrointestinal cancers and reproductive system cancer) and 170 normal controls as the healthy control group.The contrastive analysis was performed.Furthermore the analysis was conducted according to whether having tumor metastasis and chemotherapeutic cycles.ResultsThe total absolute value of the lymphocytes and the proportion of CD3+CD4+cells in the patients with malignant carcinoma were significantly lower than those in the healthy control group (P<0.05),but the proportions of CD3+CD8+,CD3+CD56+and CD3-CD56+cells were significantly higher than those in the healthy control group (P<0.05).The proportion of CD3+CD4+cells in the patients with tumor metastasis were significantly lower than those in the ones without tumor metastasis;but the proportions of CD3+CD8+,CD3-CD56+and CD3+CD56+cells were significantly higher than those in the ones without tumor metastasis,the differences were statistically significant(P<0.05).In the chemotherapy treatment,the proportions of CD3+CD4+,CD3+CD56+and CD3-CD56+cells were gradually increased with the increase of chemotherapeutic cycles,but the proportion of CD3+CD8+cells was gradually reduced.ConclusionIn the process of development,progression and treatment of tumor,the cellular immunity function plays a dominant role,which could be used as one of indexes for clinically monitoring the cellular immune function in the patients with tumor.

Key words:T helper cells;cytotoxic T cell;natural killer cell;natural killer T cell

收稿日期：(2015-07-30)

文獻標識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.024A

文章編號：1673-4130(2015)24-3565-03