基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(81271920、81301498)。

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熒光定量PCR檢測宮頸癌患者血清中miR-203表達水平及意義*

*基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(81271920、81301498)。

楊春蘭，申嫻娟，鞠少卿，蘇建友△

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇南通 226001)

摘要:目的建立SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測血清中miR-203的表達水平，并檢測宮頸癌患者、良性宮頸疾病及健康對照者血清miR-203的表達水平。方法設(shè)計miR-203、U6莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴增引物進行熒光定量PCR，以U6為內(nèi)參相對定量比較不同宮頸疾病患者血清中miR-203的表達水平。結(jié)果該研究建立的方法能特異性檢測到血清中miR-203的擴增信號，熔解曲線單一，PCR產(chǎn)物特異。宮頸癌患者血清中miR-203表達水平明顯高于子宮肌瘤、宮頸炎等其他良性宮頸疾病，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR是一種快速簡便、靈敏度高、特異度好的檢測方法，可能在宮頸癌輔助診斷中有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞:SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR；miR-203；宮頸癌

microRNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約為21～25個核苷酸，可與特定的目標(biāo)mRNA結(jié)合，通過促進靶mRNA的降解和(或)抑制翻譯過程而發(fā)揮負調(diào)控基因表達的作用，miRNA對疾病的影響、致病機制正成為研究的熱點[1]。miR-203是近年來發(fā)現(xiàn)的第一種皮膚特異性miRNA，不但參與調(diào)控胚胎期表皮分化、構(gòu)建皮膚保護層，并與銀屑病和牛皮癬等皮膚性疾病有關(guān)，而且作為抑癌或致癌因子與靶基因共同作用參與腫瘤細胞的增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡等[2]。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-203的異常表達與食管癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、慢性粒細胞白血病等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在世界女性癌癥發(fā)病率中排第2位,病死率排第5位。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是一個極其復(fù)雜的多階段、多基因調(diào)控異常的過程。研究表明對于在宮頸癌細胞中低表達或沉默表達的抑癌性miRNA，可通過miRNA表達載體系統(tǒng)或miRNA類似物導(dǎo)入外源miRNA，抑制腫瘤細胞生長，以治療和預(yù)防宮頸癌。研究發(fā)現(xiàn)miR-199a、miR-143、miR- 214等miRNA分子的異常表達與宮頸癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

因此，是否能將miR-203作為一個新標(biāo)志物，通過檢測血清中miR-203的表達量來進行宮頸癌的早期診斷和預(yù)后判斷成為此次研究的主要目的。

1資料與方法

1.1一般資料宮頸癌患者7例、子宮肌瘤患者5例、宮頸炎患者5例及健康對照組7例，年齡41～65歲，平均48歲，來自南通大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.2儀器與試劑主要儀器有高速冷凍離心機(日本HiTachi公司)，紫外分光光度計(德國Iimplen公司)，7500 Real Time PCR System(美國ABI公司)，-80 ℃低溫冰箱(日本Sanyo公司)，熒光定量PCR八連管(美國Axygen公司)。試劑主要有總RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司)，miR-203和U6 RT Primer、Bulge-LoopTM miRNA Primer (廣州銳博生物科技有限公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑，MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×)(立陶宛Fermentas公司)，DNA 引物(大連TakaRa生物工程公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集采用分離膠的真空采集管收集血液標(biāo)本，1 000 r/min離心10 min后，將上層血清分裝于Rnase-free的EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2血清RNA提取用QIAGEN miRNeasy Mini kit試劑盒內(nèi)的QIAzol、RWT、RPE試劑以及吸附柱提取血清RNA，最終溶于40 μL nuclease-free H2O中。用紫外分光光度計測得RNA濃度及純度，取適量模板進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.3.3cDNA的合成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA 500 ng，62.5 nmoL莖環(huán)狀逆轉(zhuǎn)錄引物1.6 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，dNTP(10 mmol)2 μL，RNase inhibitor(20 u/μL)，Reverse Transcriptase(200 u/μL)1 μL，nuclease-free H2O補足至20 μL，混勻，瞬時離心。反應(yīng)條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置-20 ℃保存。

1.3.4實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為SYBR GreenⅠmix(Rox)9 μL，cDNA 5 μL，上、下游引物各2 μL，miR-203正向引物序列：5′-GUG AAA UGU UUA GGA CCA CUA G-3′，反向引物序列：5′-CCA GUG GUU CUU AAC AGU UCA AC-3′；U6正向引物序列：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，反向引物序列：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。RNase-free H2O補足至20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 min，40個循環(huán)，60~95 ℃收集熒光繪制熔解曲線。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理本次實驗采用比較Ct值法，首先將兩項平行反應(yīng)取平均Ct值，△Ct=Ct (miR-203)―Ct (U6snRNA)，基因相對表達量采用2-△Ct方法計算。所有資料用Graphpad Prism5軟件進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果

樣品總 RNA 的OD260/OD280值在1.8左右，見圖1，提取純度較好，可進行下一步的熒光定量的反應(yīng)。根據(jù)測得的濃度加入5 μL cDNA模板擴增。

圖1　　1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量

從熔解曲線圖上可以看出，miR-203、U6的熔解曲線峰值單一，略有差異，見圖2(見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)，miR-203熔解溫度為79.55 ℃左右，U6熔解溫度為83.06 ℃左右。表明 PCR 參數(shù)選擇適當(dāng)，miR-203、U6逆轉(zhuǎn)錄引物和擴增引物能夠擴增出miR-203、U6片段，產(chǎn)物特異度較好，非特異產(chǎn)物對結(jié)果影響較小。

miR-203的real-time PCR擴增曲線宮頸原位癌患者血清中miR-203與U6 snRNA反應(yīng)曲線呈標(biāo)準S型，見圖3(見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。在本試驗中，U6在所有標(biāo)本中都有穩(wěn)定表達，且Ct值比較集中，在22±2之間，可作為該實驗的內(nèi)參照。

血清miR-203 PCR反應(yīng)曲線呈標(biāo)準S型，通過計算得出24份樣本的血清中miR-203檢測結(jié)果：7位宮頸原位癌患者Ct值結(jié)果為16.21、15.38、14.98、17.21、16.68、13.98、15.49；5位子宮肌瘤患者結(jié)果為22.11、23.58、25.87、27.58、26.24；5位宮頸炎患者結(jié)果為21.80、24.86、22.84、23.16、22.69；7位健康對照組結(jié)果為24.30、25.64、23.24、26.14、23.54、22.57、25.47。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清中miR-203表達水平明顯高于子宮肌瘤和宮頸炎患者(P<0.05)。子宮肌瘤和宮頸炎患者血清中miR-203表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

早期宮頸癌大多數(shù)患者通過手術(shù)或放射治療可以控制病情，有一個相對有利的預(yù)后。但是，仍有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的患者漏診率很高。目前，用于檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的各種方法，如CT、MR和PET-CT，均具有較低的敏感度和特異度。最近研究表明，血清中含有大量來自不同組織的穩(wěn)定miRNA。

Chen等[3]首次研究證實血清miRNA可以作為潛在的腫瘤標(biāo)志物，研究結(jié)果顯示彌漫性大B淋巴細胞瘤患者血清中miR-155、miR-210、miR-21 表達量明顯高于健康對照組，而且miR-21 的表達水平與患者存活率密切相關(guān)。隨后有大量研究證實血清miRNA可作為多種腫瘤輔助診斷、鑒別診斷、預(yù)后判斷、病程監(jiān)測的標(biāo)志物[4]。如胰腺癌患者血清中7種miRNA分子(miR-20a，miR-21，miR-24，miR-25，miR-99a，miR-185，miR-191)表達明顯上調(diào)，且miRNA-21表達水平與胰腺癌患者的存活率密切相關(guān)；前列腺癌患者血清中miRNA-375，miRNA-141表達上調(diào)，其表達水平和格里森指數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等高度相關(guān)。目前，通過對宮頸癌相關(guān)miRNA進行鑒定和功能分析，已發(fā)現(xiàn)宮頸癌中有明確靶基因的miRNA差異表達譜，如 miR- 21、miR- 34a、miR-143等，可能為宮頸癌診斷和鑒別診斷提供有價值的參考指標(biāo)。

在多種腫瘤中，miR-203的異常表達已經(jīng)被多次指出。如肺癌、胰腺癌、膀胱癌患者miR-203的高表達。Cheung等[5]研究發(fā)現(xiàn)miR-20a和miR-203與宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在本次研究中，筆者建立了SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測血清miR-203的方法，該方法快速簡便、敏感度高、特異度好。并運用該方法檢測發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血清中miR-203表達水平明顯高于子宮肌瘤和宮頸炎患者，子宮肌瘤和宮頸炎患者血清中miR-203表達水平?jīng)]有顯著差別，其可能會對宮頸癌輔助診斷有一定作用。

由于標(biāo)本量較少，在建立了較成熟的方法后還需增加標(biāo)本量的檢測，需要進一步說明試驗的重復(fù)性和穩(wěn)定性。此外，由于miR-203在多種腫瘤組織中表達量都有升高，是否可以通過兩種或多種miRNA聯(lián)合診斷宮頸癌也為日后的研究提供了一個方向。

參考文獻

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[3]Chen X,Ba Y,Ma L,et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res,2008,18(10):997-1006.

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·論著·

Serum miR - 203 expression level detected by fluorescence quantitative PCR in cervical cancer patients and its significance

YangChunlan,ShenXianjuan,JuShaoqin,SuJianyou△

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China)

Abstract:ObjectiveTo establish the method of the SYBR Green Ⅰ real-time fluorescent quantitative PCR for detecting the serum miR-203 expression level,and to detect the serum miR-203 expression levels in the patients with cervical cancer,cervical benign diseases and healthy controls.MethodsThe miR-203,U6 stem loop RT primers and the PCR amplification primers were designed for conducting fluorescence quantitative PCR,with U6 as the internal relative quantification,the serum miR-203 levels were compared among different cervical diseases.ResultsThe established method could specifically detect the amplification signal of serum miR-203,the melting curve was single and PCR products were specific.The serum miR-203 level in the patients with cervical cancer was significantly higher than that in the patients with benign cervical diseases such as hysteromyoma and cervicitis,the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionThe SYBR Green Ⅰ real-time fluorescent quantitative PCR is a quick,simple detection method with high sensitivity and good specificity,which may have a better application prospect in cervical cancer auxiliary diagnosis.

Key words:SYBR Green Ⅰ real-time fluorescent quantitative PCR;miR-203;cervical cancer

收稿日期：(2015-06-22)

文獻標(biāo)識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.018A

文章編號：1673-4130(2015)24-3552-02

通訊作者：△E-mail:src85822584@sina.com。

作者簡介：楊春蘭，女，副主任技師，主要從事臨床生化與免疫學(xué)工作。 韓富秋，女，副主任檢驗師，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗工作。△，E-mail:dhr06@163.com。