于魁魁，謝　凱

(徐州市中心醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州 221100)

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銅綠假單胞菌耐藥性檢測及整合子分布

于魁魁，謝凱△

(徐州市中心醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州 221100)

摘要:目的了解臨床分離銅綠假單胞菌(PA)的耐藥特征及耐藥整合子分布，探討整合子攜帶與耐藥的關系。方法收集并保存該院臨床分離的非重復PA菌株260株；藥物敏感試驗采用紙片法(K-B法)；藥物敏感結果統計分析采用WHONET5.0軟件；整合子檢測采用聚合酶鏈式反應(PCR)方法。結果臨床分離的260株PA菌株對14種抗菌藥物耐藥率由低到高依次為：亞胺培南(18.5%)、阿米卡星(18.8%)、頭孢吡肟(20.3%)、哌拉西林/他唑巴坦(21.5%)、頭孢他啶(22.6%)、氨曲南(31.9%)、妥布霉素(31.9%)、頭孢哌酮(38.1%)、慶大霉素(38.8%)、哌拉西林(41.9%)、環(huán)丙沙星(49.2%)、頭孢噻肟(61.9%)和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶(70.4%)；檢出Ⅰ類整合子陽性菌株109株(41.9%)，Ⅱ類整合子4株(1.5%)，未檢測出Ⅲ類整合子；發(fā)現除多黏菌素外，Ⅰ類整合子檢測陽性菌株對不同種類抗菌藥物的耐藥率明顯高于Ⅰ類整合子檢測陰性菌株，差異有統計學意義(P<0.05)。結論該地區(qū)臨床分離PA菌株攜帶整合子類型為Ⅰ、Ⅱ型，菌株攜帶整合子與該地區(qū)PA耐藥密切相關。

關鍵詞:銅綠假單胞菌；整合子；耐藥性

銅綠假單胞菌(PA)是引起醫(yī)院內感染的重要條件致病菌之一。近年來隨著抗菌藥物的廣泛使用，特別是抗菌藥物的不合理使用，PA的耐藥性逐漸增加，多重耐藥形式也十分嚴峻，給臨床抗感染治療造成極大的困難。PA的耐藥機制較為復雜，除其本身表現出對多種抗菌藥物天然耐藥外，該菌也可以通過一些基因水平傳播元件的參與，從而迅速獲取外界耐藥基因。整合子是近年來發(fā)現的一組基因水平轉移元件，與PA耐藥的形成密切相關。目前已經出現3種類型的耐藥整合子，其中Ⅰ和Ⅱ類整合子最為普遍，且與臨床的關系也最為密切[1-2]。為了解整合子攜帶與PA耐藥的關系，本研究對本地區(qū)臨床收集的260株PA菌株的耐藥性及整合子加以檢測，現報道如下。

1材料與方法

1.1菌株來源本院2013年7月至2014年6月臨床分離非重復PA菌株260株，其中分離自痰液標本198株(76.15%)，尿液標本23株(8.85%)，血液標本10株(3.85%)，引流液標本10株(3.85%)，分泌物標本5株(1.92%)，其他種類標本14株(5.38%)。

1.2方法

1.2.1細菌鑒定采用法國生物梅里埃公司VITEK2 Compact全自動細菌鑒定系統進行菌株的鑒定。

1.2.2藥物敏感試驗藥物敏感試驗采用紙片擴散法(K-B法)，結果判讀參照美國臨床實驗室標準化協會(CLIS)2010年標準[3]。共測試14種抗菌藥物，包括哌拉西林(PRL，30 μg)、頭孢哌酮(CFP，75 μg)、頭孢他啶(CAZ，30 μg)、頭孢噻肟(CTX，30 μg)、頭孢吡肟(FEP，30 μg)、亞胺培南(IPM，10 μg)、氨曲南(ATM，30 μg)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP，100 μg/10 μg)、阿米卡星(AK，30 μg)、慶大霉素(GEN，10 μg)、妥布霉素(TOB，10 μg)、環(huán)丙沙星(CIP，5 μg)、多黏菌素(PB，300 U)和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶(SXT，1.25 μg/23.75 μg)。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，均來自江蘇省臨床檢驗中心。

1.2.3整合子基因檢測細菌模板提取采用煮沸方法。引物設計參照文獻[4]，見表1。引物由上海英駿公司負責合成。聚合酶鏈式反應(PCR)產品購自大連寶生生物公司。整合子基因PCR反應體系為50 μL，包括10×PCR反應緩沖液5.0 μL、dNTP 4.0 μL、引物各1 μL、模板2 μL、Taq酶1 μL，最后加蒸餾水至50 μL。PCR反應參數：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，反應35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。1%的凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。

表1　整合酶基因檢測所需的引物序列

1.3統計學處理藥敏結果中介歸于耐藥，并將藥敏結果輸入WHONET5.0軟件進行分析，率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1PA對14種抗菌藥物的耐藥性260株PA對CTX和SXT的耐藥率高(均大于60%)，對IPM和AK的耐藥率低(均小于20%)，對PB全敏感。對其他種類抗菌藥物的耐藥率由低到高依次為：FEP(20.3%)、TZP(21.5%)、CAZ(22.6%)、ATM(31.9%)、TOB(31.9%)、CFP(38.1%)、GEN(38.8%)、PRL(41.9%)及 CIP(49.2%)。見表2。

表2　　PA菌株對14種抗菌藥物的耐藥率(n=260)

2.2PA主要多重耐藥模式以耐3種以上抗菌藥物為多重耐藥菌株，本次臨床分離的PA菌株有123株呈多重耐藥，多重耐藥率為47.3%。多重耐藥模式以對β-內酰胺類、氨基糖苷類及喹諾酮類抗菌藥物同時耐藥為主，共89株(34.2%)。

2.3Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ類整合子分布260株PA共檢出Ⅰ類整合子陽性菌株109株，檢出率為41.9%；檢出Ⅱ類整合子陽性菌株4株，檢出率為1.5%，且4株Ⅱ類整合子陽性菌株同時也檢出Ⅰ類整合子；未檢出Ⅲ類整合子。Ⅰ、Ⅱ類整合子PCR結果，見圖1、2。

圖1　?、耦愓献覲CR檢測結果

圖2　?、蝾愓献覲CR檢測結果

2.4Ⅰ類整合子與PA菌株耐藥的關系Ⅰ類整合子檢測陽性PA菌株對不同種類的抗菌藥物耐藥率除PB外，均明顯高于Ⅰ類整合子檢測陰性的菌株，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網站主頁“論文附件”)。

2.5Ⅰ類整合子與PA多重耐藥的關系109株Ⅰ類整合子檢測陽性PA菌株有87株呈多重耐藥，多重耐藥率為79.8%；151株Ⅰ類整合子檢測陰性菌株有36株呈多重耐藥，多重耐藥率為23.8%。經χ2檢驗，兩者多重耐藥率差異有統計學意義(χ2=5.26，P<0.01)。

3討論

β-內酰胺類抗菌藥物具有抗菌譜廣、抗菌能力強及不良反應少的優(yōu)點，是治療PA感染的首選藥物。本次耐藥檢測結果顯示，PA對此類藥物的耐藥率由低到高依次為IPM(18.5%)、FEP(20.3%)、TZP(21.5%)、CAZ(22.6%)、ATM(31.9%)、CFP(38.1%)、PRL(41.9%)、CTX(61.9%)。結果表明，PRL和CTX對PA的抗菌活性差，已不適于PA感染的常規(guī)治療，而IPM仍顯示出對PA良好的抗菌活性，可以用作治療PA引起的重度感染的首選藥物，其他種類藥物可以依據藥敏結果合理使用。本次檢測IPM的耐藥率為18.5%,略低于2010年中國東北、西南及華南地區(qū)耐藥性監(jiān)測結果[5-7]，原因可能與各地區(qū)之間的藥物使用差別有關。值得注意的是，絕大多數IPM耐藥菌株呈現一定的泛耐藥性，表現出對除PB外所有的抗菌藥物耐藥。結果提示此類菌株感染的治療，臨床可以選擇的藥物有限，因此加強泛耐藥菌株流行趨勢監(jiān)測具有十分重要的意義。

氨基糖苷類抗菌藥物是治療革蘭陰性桿菌感染的又一類強效藥物，與β-內酰胺類抗菌藥物聯合使用可以產生強大的抗菌效果。近年來，PA對此類藥物耐藥率呈上升趨勢。資料顯示，1994～2008年，PA對AK的耐藥率由11.0%上升至25.7%，對TOB的耐藥率由17.7%上升至38.6%，對GEN的耐藥率由42.1%上升至62.2%[8-9]。本次耐藥檢測結果顯示，PA對AK、TOB及GEN的耐藥率分別為18.8%、31.9%及38.8%。結果明顯要低于上述耐藥監(jiān)測地區(qū)的報道，可能與地區(qū)間的用藥習慣有關，細菌耐藥存在明顯的地區(qū)差異。本次檢測PA對CIP的耐藥率為49.2%，明顯高于原衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網西北地區(qū)(19.7%)、華北地區(qū)(23.1%)、東北地區(qū)(27.0%)及西南地區(qū)(42.6%)耐藥率的報道[5-7]，結果可能與本地區(qū)CIP的使用量增加，導致PA耐藥率上升有關。

PA耐藥機制比較復雜，包括固有耐藥機制及獲得性耐藥機制。PA固有耐藥機制主要是由于其低滲透性能力外膜蛋白、染色體編碼的AmpC酶及主動外排所介導。PA的獲得性耐藥機制則是通過自身基因組突變或者是通過水平獲取外界耐藥基因的方式獲得對藥物的耐藥性，而后者是導致PA迅速耐藥及耐藥范圍擴大最為直接的原因。在上述耐藥性獲取過程中，整合子起了重要作用。典型的整合子結構是由兩端的保守區(qū)和中間可變區(qū)組成。保守區(qū)分5′端和3′端。5′端保守區(qū)域即整合酶活性區(qū)域，具有整合和切除耐藥基因的功能；3′端保守區(qū)包含qacΔE和sul基因，分別編碼對季銨鹽化合物及磺胺的耐藥[10]；可變區(qū)是由一系列串聯排列的耐藥基因盒組成。整合子本身不可以移動，但是其常位于可移動基因元件如轉座子和質粒上，從而介導耐藥基因水平轉移[11]。根據整合酶基因編碼氨基酸的差異，目前已經出現了4種耐藥相關整合子，其中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類整合子與耐藥基因的轉移密切相關[12]。

本研究在260株PA菌株中共檢出109株Ⅰ類整合子陽性菌株，檢出率為41.9%；檢出4株Ⅱ類整合子陽性菌株；未發(fā)現Ⅲ類整合子。檢測結果表明，Ⅰ類整合子是所有整合子類型中分布最為廣泛的一種，而Ⅱ、Ⅲ類整合子比較少見，這與國內外文獻報道相一致[13]。此外，研究發(fā)現4株Ⅱ類整合子陽性PA菌株也同時攜帶Ⅰ類整合子，這也表明PA菌株的耐藥可以由Ⅰ、Ⅱ類整合子共同介導。有關PA菌株同時攜帶Ⅰ、Ⅱ類整合子的情況，國內已有相關文獻報道，但比較少見，本研究結果再次證實此種菌株在國內的流行[14]。本研究發(fā)現，攜帶Ⅰ類整合子的PA菌株對除PB外的所有測試抗菌藥物的耐藥率明顯高于Ⅰ類整合子檢測陰性菌株，提示攜帶Ⅰ類整合子的PA菌株更容易形成耐藥。另外，本研究還發(fā)現，攜帶Ⅰ類整合子的PA菌株其多重耐藥率也明顯高于Ⅰ類整合子檢測陰性菌株。這一結果說明攜帶Ⅰ類整合子的PA菌株具有一定的多重耐藥性。研究表明，整合子不僅可以整合外界耐藥基因，并且可以充分表達這些耐藥基因。這些基因以基因盒形式排列于整合子可變區(qū)，因此，整合子攜帶的菌株往往表現多重耐藥[15]。目前已經發(fā)現的耐藥基因盒約200多種，編碼的耐藥基因包含了對β-內酰胺類、氨基糖苷類及喹諾酮類等抗革蘭陰性桿菌關鍵藥物耐藥。本試驗初步證實了Ⅰ類整合子攜帶與這些藥物耐藥形成的相關性，然而是否在這些菌株整合子可變區(qū)攜帶相關耐藥基因盒有待進一步深入研究。

綜上所述，本研究表明，在臨床微生物實驗室開展整合子檢測不僅有助于監(jiān)測菌株耐藥動態(tài)，控制耐藥菌株的傳播和流行，而且可以通過對整合子介導的分子耐藥機制的深入研究，開發(fā)新型抗菌藥物種類，為臨床治療，延緩耐藥菌株的發(fā)生都有積極的意義。

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·論著·

The detection of drug resistance and prevalence of integrons in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa

YuKuikui，XieKai△

(DepartmentofClinicalLaboratory,XuzhouCentralHospital,Xuzhou,Jiangsu221100,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the drug resistance and prevalence of integrons in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa(PA) and to analyze the correlation between presence of integrons and drug resistance.MethodsA total of 260 non-repetitive clinical isolates of PA were obtained from this Hospital;antimicrobial susceptibility testing was performed by using the K-B disk diffusion methods;statistical analysis was performed by using the WHONET5.0 software.Integrons were detected by using polymerase chain reaction(PCR).ResultsAmong the 260 clinical isolates of PA,the resistance rates against 14 antibacterial agents from low to high were imipenem(18.5%),amikacin(18.8%),cefepime(20.3%),piperacillin/tazobactam(21.5%),ceftazidime pentahydrate(22.6%),aztreonam(31.9%),tobramycin(31.9%),cefoperazone(38.1%),gentamicin(38.8%),piperacillin(41.9%),ciprofloxacin(49.2%),cefotaxime(61.9%) and sulfamethoxazole/trimethoprim(70.4%),respectively.A total of 109 isolates presented Class Ⅰ integrons and 4 isolates presented class Ⅱintegrons,while no class Ⅲ integrons were found in any isolates.Except for polymyxin,the resistance rates of class Ⅰ integrons positive isolates against antibacterial agents examined in this study were significantly higher than those of class Ⅰ integrons negative isolates (P<0.05).ConclusionThe classⅠand class Ⅱ integrons are the prevalent types in the local region,which might be closely related to the drug resistance in clinical isolates of PA.

Key words:Pseudomonas aeruginosa；integron；drug resistance

作者簡介：遲紹琴，女，主任檢驗技師，主要從事分子生物診斷學研究。

收稿日期：(2015-07-05)

文獻標識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.016A

文章編號：1673-4130(2015)24-3547-03