基金項目:廣東省人口和計劃生育委員會科研項目(2012338)。

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反向蛋白質(zhì)微點陣對懷孕女性TORCH感染的檢測*

*基金項目:廣東省人口和計劃生育委員會科研項目(2012338)。

何文軍1，唐芳2，李濤1，吳子安1，吳新忠1，江帆2，左連東2，余婷玉1，譚志容1，徐寧1△

(1.廣東省中醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510120；2.廣州市人口和計劃生育科學(xué)研究所，廣東廣州 510410)

摘要:目的評價反向蛋白質(zhì)微點陣方法是否能用于懷孕女性TORCH感染的檢測。方法建立檢測TORCH感染的反向蛋白質(zhì)微點陣方法，比較反向蛋白質(zhì)微點陣和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測2 000份懷孕女性的新鮮血清TORCH感染的陽性符合率，評價反向蛋白質(zhì)微點陣檢測TORCH的可行性。結(jié)果建立的反向蛋白質(zhì)微點陣方法與ELISA方法對TORCH感染檢測的陽性符合率分別為100.0%、91.1%、97.2%、91.3%和93.0%，通過蛋白芯片法與ELISA法各項指標(biāo)檢測結(jié)果均具有較好的一致性 (P>0.05)，但反向蛋白質(zhì)微點陣對風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒和皰疹病毒的檢測率高于相對應(yīng)的ELISA方法。結(jié)論反向蛋白微點陣法檢測TORCH感染，具有簡便、快速，敏感性較高和特異性強等優(yōu)點，是臨床優(yōu)生優(yōu)育輔助診斷的有效方法，未來值得推廣使用。

關(guān)鍵詞:反向蛋白質(zhì)微點陣；TORCH感染；酶聯(lián)免疫吸附試驗

優(yōu)生優(yōu)育是提高人口素質(zhì)的重要手段，世界各國非常重視產(chǎn)前診斷。孕期致畸病原體感染是重要的致畸因素之一，可導(dǎo)致大量畸形兒的出生，給家庭與社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。這些病原體主要包括弓形體、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒Ⅰ、Ⅱ型及其他感染(包括微小病毒屬、人免疫缺陷病毒、肝炎病毒、梅毒螺旋體等)。這些病原體均能通過胎盤垂直傳播給胎兒，還可通過孕婦下生殖道逆行擴散，引起胎兒感染以及胎兒分娩時的圍產(chǎn)期感染，導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎或胎兒宮內(nèi)生長遲緩(IUGR)、智力發(fā)育不全、小頭畸形、腦水腫、聽力障礙等先天畸形，以及新生兒感染、青春期發(fā)育障礙，臨床上稱為TORCH 綜合征。但這類感染對孕婦本身影響較小，常缺乏明顯臨床癥狀。孕婦感染并不代表胎兒感染，對這些孕婦的胎兒進行產(chǎn)前診斷、確診宮內(nèi)感染非常重要。(鑒于對 TORCH感染潛伏性、危害性的認(rèn)識，和目前早期診斷與有效治療手段的欠缺，重視對孕婦的產(chǎn)前 TORCH 感染的篩查診斷，以及對感染孕婦的胎兒進行產(chǎn)前診斷，以確診是否存在宮內(nèi)感染)。目前，在美國孕婦常規(guī)檢查風(fēng)疹病毒、乙型肝炎病毒、梅毒螺旋體、B 組鏈球菌和人免疫缺陷病毒[1]，在中國北京地區(qū)也已將圍產(chǎn)期檢測 TORCH 感染列為常規(guī)檢測項目。

TORCH 感染的診斷主要依靠病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷。這些方法存在各種各樣的缺陷，如病原學(xué)診斷包括顯微鏡檢查、動物接種、組織細(xì)胞培養(yǎng)病理檢查等，但其陽性率較低，往往受到條件限制，檢測時間較長，且需要活體微生物方可檢測，因此不適用于臨床篩查[2]。應(yīng)用普通的免疫學(xué)技術(shù)進行孕婦的血清學(xué)檢測作為圍產(chǎn)期感染的主要診斷方法已有許多年。目前大多數(shù)實驗室采用酶免疫技術(shù)中的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的方法檢測病原體特異性 IgG 和 IgM 來診斷孕婦的感染[3-4]，但此類方法每次所檢測的病原體種類有限，需對各病原體逐一檢測，費用較高，患者難以承受。分子生物學(xué)技術(shù)普遍存在著擴增產(chǎn)物易污染而導(dǎo)致假陽性、操作繁瑣、檢測費用較高等缺點，不適合高通量檢測。

隨著反向蛋白質(zhì)微點陣技術(shù)的發(fā)展，反向蛋白質(zhì)微點陣也越來越多用于臨床標(biāo)本的檢測以及蛋白質(zhì)相互作用的研究[5]。在本研究中，設(shè)計反向蛋白質(zhì)微點陣檢測TORCH感染，并與常規(guī)TORCH的檢測方法對比，評價該反向蛋白質(zhì)微點陣檢測TORCH的靈敏度、特異度等，為該方法的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源新鮮血清標(biāo)本2 000份，均來自本院和廣州市人口和計劃生育科學(xué)研究所婦科門診進行孕期體檢的孕婦，年齡19～40歲，室間質(zhì)評標(biāo)本來自國家衛(wèi)計委臨床檢驗中心。

1.2反向蛋白質(zhì)微點陣的設(shè)計所有TORCH的蛋白抗原購自Sigma公司，委托深圳市賽爾生物科技有限公司加工成 反向蛋白質(zhì)微點陣或蛋白質(zhì)微點陣，即先把TORCH病原體的抗原定量后固定在硝酸纖維包被的玻片上，然后用標(biāo)準(zhǔn)的抗體或被TORCH感染后的血清孵育，用洗滌液洗滌沒有結(jié)合的血清或抗體標(biāo)本，然后加入生物素標(biāo)記的抗IgM抗體孵育后，洗滌再加入顯色液進行顯色，信號用Dakocytomation-催化系統(tǒng)擴增掃描，用商品化的軟件Microvigene獲得信號強度(圖1)。

圖1　　反向蛋白微點陣檢測示意

1.3反向蛋白質(zhì)微點陣對TORCH感染標(biāo)本的檢測血清標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液按1∶20進行稀釋后取 200 μL加于芯片槽中，布滿芯片方槽，置于37 ℃溫育30 min，洗滌3次，吸干水滴后,加示蹤物2滴，37 ℃溫育30 min；洗滌3次，吸干水滴，加顯色劑1滴，37 ℃顯色 8～12 min，甩干后于蛋白芯片閱讀儀下進行灰度值掃描，通過與cutoff值的比值 (T/cutoff)對檢測結(jié)果進行判斷，比值大于或等于1.00為陽性，小于1.00者為陰性。

1.4ELISA檢測TORCH感染標(biāo)本ELISA試劑盒檢測新鮮血清樣品，操作按照試劑盒說明書。血清標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液按1∶80進行稀釋后，取100 μL已稀釋標(biāo)本加于微孔板中，室溫反應(yīng)30 min，洗滌3次，加酶標(biāo)抗體100 μL，室溫反應(yīng)30 min，再洗滌3次，加入TMB底物100 μL，室溫避光顯色10 min，用終止液終止反應(yīng)后，用ST-360酶標(biāo)儀在450 nm下進行結(jié)果判讀。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。各組間陽性率比較用配對χ2檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1反向蛋白質(zhì)微點陣對標(biāo)準(zhǔn)TORCH抗原的檢測采用標(biāo)準(zhǔn)的TORCH抗原先包被，然后用衛(wèi)計委臨床檢測中心提供的TORCH陽性和陰性樣品對設(shè)計的反向蛋白質(zhì)微點陣進行檢測。結(jié)果同預(yù)期的完全一致，所有的陽性樣品均為陽性，所有的陰性樣品為陰性。然后對陽性樣品進行稀釋檢測，當(dāng)樣品以1∶40稀釋后仍可檢測到陽性信號。上述結(jié)果表明設(shè)計的反向蛋白質(zhì)微點陣能夠檢測TORCH感染。

2.2反向蛋白質(zhì)微點陣對臨床樣品的檢測用反向蛋白質(zhì)微點陣對新鮮的孕檢標(biāo)本進行TORCH檢測，同時用ELISA試劑盒檢測TORCH感染，結(jié)果見表1。

表1　　比較反向蛋白質(zhì)微點陣和ELISA方法檢測孕婦的TORCH感染[n(n)]

()：用ELISA的檢測結(jié)果。

3討論

反向蛋白質(zhì)微點陣是將待分析樣品固定在經(jīng)過特殊處理的玻片上，然后用抗體對那些待分析樣品進行分析(圖1)。該技術(shù)是在傳統(tǒng)的正向蛋白微點陣技術(shù)基礎(chǔ)上于2001年創(chuàng)立，最初是從腫瘤組織獲取細(xì)胞群，分析存活前檢查點和生長調(diào)節(jié)蛋白的狀態(tài)[6]。之后，反向蛋白質(zhì)微點陣技術(shù)被許多研究者采用，不僅用于脂膜微囊組織，而且用于各種其他生物樣品，包括異質(zhì)性的組織樣品、細(xì)胞培養(yǎng)物、血清/血漿樣品、卵巢流出物、針吸樣品和多肽[5]。目前反向蛋白質(zhì)微點陣不被限于臨床前研究，而且還可以用于癌癥的臨床試驗檢測、細(xì)胞途徑的鑒定、細(xì)菌感染檢測[7-9]、免疫性疾病和病毒-宿主的相互作用[9-11]。反向蛋白質(zhì)微點陣能夠檢測疾病和非疾病狀態(tài)下治療前、中和后的蛋白動力學(xué)[12]，能同時定量檢測多個樣品的蛋白表達水平[5,13]。

蛋白質(zhì)微點陣技術(shù)提供了必要的分析靈敏度，甚至能檢測超低豐度的蛋白，主要由于其靈敏度增加、減少樣品體積/濃度的要求，在一個芯片上可以分析數(shù)千個樣品。反向蛋白質(zhì)微點陣不是2個位點的夾心類型抗體點陣，僅需要一個抗體用于檢測，待分析的數(shù)目遠(yuǎn)大于正向蛋白質(zhì)點陣。典型的反向蛋白質(zhì)微點陣只需要納米級別的樣品。這些待分析物來源于培養(yǎng)的細(xì)胞或體內(nèi)的動物組織或臨床樣品。每個分析的樣品點大小從幾十到幾百微米，因此，反向蛋白質(zhì)微點陣具有高通量，可以同時分析數(shù)千個樣品，其檢測的原理類似其他免疫實驗。

本研究中的陽性對照也來自衛(wèi)計委的臨床檢測中心，保證了陽性標(biāo)本的可靠性。在反向蛋白質(zhì)芯片的點陣設(shè)計上，每個TORCH感染均設(shè)置2個陽性復(fù)孔和2個陰性對照復(fù)孔。用反向蛋白質(zhì)微點陣對衛(wèi)計委臨床檢測中心提供的TORCH質(zhì)控品的檢測結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果一致，此外與其他抗體沒有交叉反應(yīng)。用反向蛋白質(zhì)微點陣對臨床收集的TORCH感染樣品進行檢測，對于弓形蟲的檢測，蛋白芯片檢測與常規(guī)的ELISA試劑盒的檢測陽性符合率為100%(P>0.05)，證明反向蛋白質(zhì)微點陣檢測弓形蟲感染具有和ELISA方法相類似的靈敏度和特異度。對于風(fēng)疹病毒的檢測，反向蛋白質(zhì)微點陣的檢測陽性率高于ELISA試劑盒，后來對反向蛋白質(zhì)微點陣檢測陽性的患者隨訪，再用ELISA方法檢測證明反向蛋白質(zhì)微點陣檢測結(jié)果是正確的。該結(jié)果證明 反向蛋白質(zhì)微點陣對風(fēng)疹病毒感染的靈敏度高于ELISA方法。對于巨噬細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒的檢測，反向蛋白質(zhì)微點陣的靈敏度也高于ELISA方法。所以，從檢測的靈敏度來說，反向蛋白質(zhì)微點陣對TORCH感染的檢測超過ELISA方法。最重要的是，在一塊芯片上能同時檢測所有的TORCH項目，能同時檢測多個標(biāo)本，大大節(jié)約了成本和人力。凌云等[14]研究發(fā)現(xiàn)反向蛋白質(zhì)微點陣法檢測弓形蟲的靈敏度高于ELISA法。

盡管反向蛋白質(zhì)微點陣對TORCH感染的檢測具有簡單、快速、經(jīng)濟和靈敏度高等特點，但該方法用于臨床之前，仍需要多中心大樣品進行測試。

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·論著·

Detection of TORCH infection in pregnant women by using reverse phase protein array*

HeWenjun1，TangFang2，LiTao1，WuZian1，WuXinzhong1，JiangFan2,ZuoLiandong2，YuTingyu1,TanZhirong1,XuNing1

(1．DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialHospitalofChineseMedicine,

Guangzhou,Guangdong510120,China;2.GuangzhouMunicipalScientificResearchInstituteof

PopulationandFamilyPlanning,Guangzhou,Guangdong510410,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate whether the reverse phase protein array (RPPA) method can be used for detecting TORCH infection in pregnant women.MethodsThe RPPA method was established for detecting TORCH infection.The positive coincidence rates of TORCH infection detected by the RPPA method and ELISA method in 2000 fresh serum samples from pregnant women were compared for evaluating the feasibility of RPPA in TORCH detection.ResultsThe positive coincidence rates of established RPPA and ELISA for detecting TORCH infection was 100.0%,91.1%,97.2%,91.3% and 93.0% respectively,indicating that the detection results of various indexes by RPPA and ELISA had better consistency (P>0.05),but the positive detection rates of RPPA for Rubellavirus,CMV and HSV-1,2 were higher than those of correspondent ELISA method.ConclusionRPPA method for detecting TORCH infection has the advantages of simpleness,rapidness,high sensitivity and strong specificity,is an effective method of auxiliary diagnosis for bearing and rearing better children in clinical,and is worthy of being promoted and used in the future.

Key words:reverse phase protein array;TORCH infection;enzyme linked immunosorbent assay

收稿日期：(2015-05-24)

文獻標(biāo)識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.006A

文章編號：1673-4130(2015)24-3522-03

通訊作者△，E-mail：xuning21@163．com。

作者簡介：何文軍，男，副主任技師，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗工作。