基金項目:江西省自然科學基金項目(20114BAB215031)；江西省衛(wèi)生廳科技計劃項目(20141152)。

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CRLF2實時定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用*

*基金項目:江西省自然科學基金項目(20114BAB215031)；江西省衛(wèi)生廳科技計劃項目(20141152)。

付晶晶，李紅△，易麗君，樂萍，黃慧

(江西省兒童醫(yī)院中心實驗室，江西南昌 330006)

摘要:目的建立人細胞因子受體樣因子2(CRLF2)實時定量PCR檢測方法。方法設(shè)計特異性引物擴增目的基因CRLF2及管家基因ABL，將純化的PCR產(chǎn)物進行TA克隆，經(jīng)菌落PCR篩選并測序鑒定后，提取重組質(zhì)粒DNA，紫外分光光度計檢測濃度換算成copies/mL濃度，稀釋制備成質(zhì)粒標準品，制作標準曲線觀察靈敏度和線性范圍，同時對質(zhì)粒標準品的穩(wěn)定性進行評估。初步應(yīng)用該方法檢測10例健康兒童和10例急性淋巴細胞白血病(ALL)初診兒童的骨髓單個核細胞CRLF2水平。結(jié)果CRLF2 PCR產(chǎn)物具有單一特異的熔解曲線；標準品的線性檢測范圍為103～108copies/mL；質(zhì)粒標準品反復(fù)凍融 3 次仍舊穩(wěn)定；臨床標本的 CRLF2 水平均在標準品線性檢測范圍。結(jié)論該實驗室建立的 CRLF2 實時定量 PCR 檢測方法具有良好的特異性、線性范圍和穩(wěn)定性，可應(yīng)用于臨床 ALL 兒童 CRLF2 基因的定量檢測。

關(guān)鍵詞:實時定量聚合酶鏈反應(yīng)；急性淋巴細胞白血病；細胞因子受體樣因子2；質(zhì)粒標準品

盡管新化療藥物及聯(lián)合化療方案應(yīng)用，使得兒童急性淋巴細胞白血病(ALL) 無事件生存率取得長足進步，但仍有 20% 患兒對化療不敏感或因化療過度導致復(fù)發(fā)或第二腫瘤發(fā)生。因此，尋找與預(yù)后相關(guān)的分子靶標進行分層治療和療效評估，將有益于進一步提高兒童 ALL 的治愈率[1]。對細胞因子受體樣因子2(CRLF2)的臨床研究發(fā)現(xiàn)，ALL 兒童骨髓單個核細胞(BMMC)中 CRLF2 高表達水平與預(yù)后不良相關(guān)[2]。因此，本實驗組擬建立 CRLF2 的實時定量 PCR(RQ-PCR)檢測方法，用于ALL兒童 CRLF2 基因檢測，為診斷兒童ALL和個體化治療提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料健康對照組及ALL兒童的BMMC及臨床信息由本院中心實驗室標本庫提供，兒童年齡1~15歲，中位數(shù)3.2歲，所有標本取材均獲兒童監(jiān)護人知情許可。

1.2引物設(shè)計根據(jù)Genbank中人的CRLF2和ABL基因序列，選擇保守區(qū)用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，經(jīng)Blast驗證后交由上海英駿公司合成。目的基因CRLF2 上游引物：5′-GTT CAG TAC CGG AGC CCC TTC-3′，下游引物：5′-GTT TGG GAG GCG TTG GTG TC-3′，預(yù)計擴增長度為232 bp；內(nèi)參基因ABL上游引物：5′-TCA TCA CCA CGC TCC ATT AT-3′，下游引物：5′-CAC CGT CAG GCT GTA TTT CT-3′，預(yù)計片段長度為178 bp 。

1.3儀器與試劑低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；-80 ℃超低溫冰箱、Nanodrop2000(美國Thermo Fisher公司)；熒光定量 PCR儀(美國ABI公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio rad公司)。Ficoll淋巴細胞分離液(北京索萊寶公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Tag酶(美國Promega公司)；Trizol、瓊脂糖粉、Platinum?SYBR?Green qPCR Super Mix-UDG試劑盒(美國Invitrogen公司)；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(美國OMEGA公司)；pEASY-T1 Simple TA克隆試劑盒(北京全式金公司)；E.coli DH5α感受態(tài)細胞為本室自制?；驕y序由上海英駿公司完成。

1.4方法

1.4.1骨髓BMMC cDNA合成參照文獻[3]和試劑說明書，提取健康對照組及ALL兒童BMMC總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，放置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2質(zhì)粒標準品的制備以健康對照組BMMC cDNA為模板，進行PCR擴增。內(nèi)參ABL擴增條件為：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；CRLF2擴增條件為：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 PCR產(chǎn)物切膠回收純化后進行 TA 克隆。將菌落PCR陽性的單克隆菌擴增提取質(zhì)粒，送測序鑒定。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒測定濃度后用TE緩沖液10倍梯度稀釋至102copies/mL，分裝后放置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3熒光定量PCR標準曲線的制作將梯度稀釋的CRLF2和ABL標準品按照優(yōu)化后的RQ-PCR條件進行定量檢測，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，并設(shè)置無模板對照(NTC)3管。PCR反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)合熔解曲線進行分析，觀察產(chǎn)物特異性。記錄標準曲線的斜率、截距以及相關(guān)系數(shù)，觀察線性范圍。

1.4.4質(zhì)粒標準品穩(wěn)定性試驗將分裝放置在-20 ℃保存的質(zhì)粒反復(fù)凍融3次，選用107、105、103copies/mL即高、中、低三個濃度同一批次質(zhì)粒進行組內(nèi)試驗，不同批次質(zhì)粒進行組間試驗，驗證質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

1.4.5臨床標本檢測檢測10例健康對照兒童和10例ALL初診兒童BMMC cDNA CRLF2 水平，每份標本同步測定內(nèi)參基因ABL，測定3個復(fù)孔；ABL Ct值大于35視為標本不合格，數(shù)據(jù)棄用；每個基因設(shè)定3管NTC；選用107、105、103copies/mL作為陽性標準品，制作標準曲線。根據(jù)標準曲線自動得到標本CRLF2、ABL的絕對定量水平，再以 CRLF2/ABL 絕對表達量比值為該標本的CRLF2相對表達水平。

2結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳以健康對照組BMMC cDNA為模板，定性PCR擴增管家基因ABL和目的基因CRLF2，擴增產(chǎn)物電泳觀察到與預(yù)計大小相符的單一條帶，見圖1(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.2重組質(zhì)粒測序鑒定篩選重組子質(zhì)粒送往測序，將測序結(jié)果與Genbank 公布序列一致的重組質(zhì)粒分別命名為pEASY-T1-Simple-ABL、pEASY-T1-Simple -CRLF2。測序結(jié)果見圖2(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.3RQ-PCR方法學評價

2.3.1特異性分析從熔解曲線可見，管家基因和目的基因都僅出現(xiàn)產(chǎn)物單峰，ABL 熔解溫度為89.0 ℃，CRLF2熔解溫度為85.1 ℃，說明引物特異性強，無非特異性擴增。見圖3(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.3.2線性范圍結(jié)果顯示，質(zhì)粒標準品在103～108copies/mL濃度間具有良好相關(guān)性。ABL標準曲線斜率為-3.65，R=0.999 9；CRLF2標準曲線斜率為-3.64，R=0.999 2，見圖4(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.3.3穩(wěn)定性分析分析結(jié)果可見，標準品批內(nèi)CV值均小于3.0%，批間CV值均小于4.0 %，NTC陰性，證實標準品及本方法的重復(fù)性良好，結(jié)果見表1。

表1　　ABL/CRLF2標準品批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗

-：無數(shù)據(jù)。

2.4臨床標本檢測應(yīng)用本系統(tǒng)檢測臨床標本，所有標本均在標準品的線性范圍，ALL組CRLF2相對表達水平顯著高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

3討論

CRLF2參與正常淋巴細胞的成熟與分化。2009年Russell等[4]首次報道CRLF2異常高表達可能是造成ALL發(fā)生的直接機制。I-Ming等[5]發(fā)現(xiàn)有17.5% ALL兒童存在由CRLF2基因異位、缺失、突變造成的失調(diào)性高表達，Harvey等[6-7]多中心臨床研究報道CRLF2高表達在ALL高危組中為預(yù)后不良的獨立危險因素，應(yīng)予以高度重視。因此，作為一個潛在判斷ALL預(yù)后的分子標志物，CRLF2定量檢測已引起ALL臨床應(yīng)用研究的重視。本研究組將CRLF2納入本院ALL分子診斷平臺建設(shè)體系中，希望建立優(yōu)良穩(wěn)定的CRLF2基因定量檢測方法，為臨床ALL兒童的個體化治療預(yù)后判斷提供參考。

相對探針法而言，SYBR Green I染料法性價比高且操作簡便，因而應(yīng)用更為廣泛，但由于SYBR Green I能與任何雙鏈DNA結(jié)合，因此需要優(yōu)化反應(yīng)體系并結(jié)合熔解曲線分析以確保反應(yīng)特異性[9]。本研究小組建立的CRLF2 RQ-PCR檢測方法經(jīng)一系列評估實驗顯示：本方法特異性強，線性范圍廣，熒光信號與擴增Ct值相關(guān)系數(shù)大于0.999，質(zhì)粒標準品經(jīng)反復(fù)凍融3次后，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均低于4%，證明該方法完全符合實驗要求，可應(yīng)用于臨床CRLF2檢測。筆者將該建立的方法初步應(yīng)用于健康及ALL兒童的臨床標本檢測，所有樣本的CRLF2 mRNA水平均在標準品線性范圍內(nèi)，因此本方法具有特異性強，可行性好的特點，完全符合檢測要求。

綜上所述，本研究成功建立了CRLF2基因RQ-PCR檢測方法，為ALL兒童個體化診療和CRLF2轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究提供了參考工具。

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·論著·

Establishment and preliminary application of real time PCR assay for quantitative detection of CRLF2*

FuJingjing,LiHong△,YiLijun,YuePing,HuangHui

(CentralLaboratory,JiangxiProvincialChildren′sHospital,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a real-time quantitative PCR method for the detection of cytokine receptor-like factor 2(CRLF2) expression.MethodsSpecific primers amplification target gene CRLF2 and housekeeping genes ABL were designed,the purified PCR products were performed the TA cloning.After bacterial colony PCR screening and sequencing,then the recombinant plasmids DNA was extracted and measured by using UV spectrophotometer and converted to copies/mL concentration.Finally it was diluted for preparing the plasmid standard substance,then the standard curve was drawn for observing the sensitivity and linear rang,meanwhile the stability of the plasmid DNA was evaluated.This method was initially applied to detect the CRLF2 level of bone marrow mononuclear cells in 10 cases of healthy children and 10 cases of newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia(ALL).ResultsCRLF2 PCR product had a single specific melting curve;the linear detection range of the standard substance was 103 - 108 copies / ml;the plasmid standard substance by freeze-thawing for 3 times remained stable;the CRLF2 level of clinical sample was within the linear detection range of standard substance.ConclusionThe real-time quantitative PCR method for CRLF2 established by our laboratory has good specificity,linearity range and stability,which can be applied to the quantitative detection of CRLF2 gene in clinical ALL children.

Key words:real-time quantitative polymerase chain reaction;cytokine receptor-like factor 2;acute lymphoblastic leukemia;plasmid standard substance

收稿日期：(2015-05-08)

文獻標識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.005A

文章編號：1673-4130(2015)24-3520-03

通訊作者△，E-mail:icemade@hotmail.com。

作者簡介：付晶晶，女，主管檢驗技師，主要從事兒童白血病分子診斷及耐藥機制研究。