基金項(xiàng)目:上海市科委課題(13DZ2293100)。

?

314例中國(guó)胃癌患者K-ras基因的突變狀態(tài)分析*

*基金項(xiàng)目:上海市科委課題(13DZ2293100)。

彭南求，趙新泰△

(上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司，上海 201900)

摘要:目的分析胃癌患者K-ras基因突變狀態(tài)，以期為胃癌患者的個(gè)體化治療提供指導(dǎo)。方法采用嵌套和COLD-PCR的方法分析314例胃癌患者K-ras基因突變狀態(tài)。結(jié)果在314例胃癌患者中，K-ras基因總體突變率是7.32%。19例血漿標(biāo)本的突變率為0%。295例組織標(biāo)本的突變率為7.80%。突變類型包括G12D、G13D、G12V，兩種不同標(biāo)本之間K-ras基因的突變率并無(wú)顯著差異(P=0.206 1)；221例男性患者的突變率為6.79%，突變類型包括G12D、G13D，93例女性患者的突變率為8.60%，突變類型包括G12D、G13D、G12V，不同性別之間K-ras基因的突變率之間無(wú)顯著差異(P=0.573 1)；45例青年人患者的突變率為6.67%，突變類型包括G12D、G13D，127例中年人患者的突變率為7.87%，突變類型包括G12D、G13D、G12V，142例老年人患者的突變率為7.04%，突變類型包括G12D、G13D，不同年齡患者K-ras基因的突變率之間無(wú)顯著差異(P=0.995 3)。結(jié)論314例胃癌患者K-ras基因突變率是7.32%，突變類型主要為G12D、G13D，K-ras基因在不同標(biāo)本類型、不同性別、不同年齡之間的突變率并無(wú)顯著差異。

關(guān)鍵詞:胃癌；K-ras；基因突變狀態(tài)

癌癥是一種高發(fā)病率、高病死率的全球性疾病，僅在2008年就造成760萬(wàn)人死亡。過(guò)去的10年中，癌癥的病死率呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，大約118萬(wàn)癌癥患者得到了有效的救治[1-2]。胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率一直居高不下，雖然手術(shù)可以根治，但術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的生存，由于缺乏對(duì)晚期胃癌及復(fù)發(fā)型胃癌的有效治療方案，目前胃癌的病死率居全世界惡性腫瘤的第2位[3]，對(duì)胃癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高臨床療效和降低病死率的有效方法[4]。K-ras基因編碼的p21-ras蛋白位于質(zhì)膜上轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的信號(hào)。K-ras突變主要發(fā)生在12、13和61編碼子上，這些突變?cè)斐蒏-ras激活[5]。K-ras突變與患者缺乏對(duì)EGFR單抗的反應(yīng)有關(guān),突變者不適用西妥昔單抗治療[6]。NCCN 2010年臨床指南中推薦：在接受西妥昔單抗治療前，進(jìn)行K-ras基因突變檢測(cè)，確定是否接受該靶向治療。

本研究采用嵌套和COLD-PCR方法研究了314例中國(guó)人胃癌腫瘤血液標(biāo)本中K-ras基因的突變狀態(tài)，同時(shí)比較了不同標(biāo)本、性別和年齡群體中K-ras基因突變頻率的差異，以期能為西妥昔單抗藥物的使用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源本研究使用的臨床標(biāo)本來(lái)自全國(guó)上百家三級(jí)醫(yī)院，包括19例血漿標(biāo)本和295例組織標(biāo)本。所有參與本研究的胃癌患者或其家屬均簽署過(guò)授權(quán)給上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行K-ras基因檢測(cè)的知情許可同意書。

1.2儀器與試劑試驗(yàn)使用的Pfu酶購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司，dNTP購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自Axygen Scientific Inc，所使用的PCR儀則購(gòu)自杭州博日科技有限公司，離心機(jī)購(gòu)自湘儀離心機(jī)儀器有限公司，PCR產(chǎn)物序列測(cè)定由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.3方法

1.3.1基因組DNA的提取按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2COLD-PCR-測(cè)序法檢測(cè)K-ras基因突變狀態(tài)用primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，嵌套和COLD-PCR-測(cè)序法被用于檢測(cè)K-ras基因的突變。

第1步 PCR擴(kuò)增，常規(guī)PCR方法被用于擴(kuò)增465 bp的大片段。所用引物為：正向， 5′-GTC GAT GGA GGA GTT TGT AAA TGA AGT-3′和反向 5′-TTC AGA TAA CTT AAC TTT CAG CAT AAT TAT CTT G-3′。10 μL PCR反應(yīng)體系，包括：0.25 mmoL的dNTP、0.5 mmoL的引物、0.5單位的Taq DNA聚合酶和10 ng的模板DNA。 PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，接著進(jìn)行32個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min。

第2步 COLD-PCR COLD-PCR方法用于擴(kuò)增155 bp的小片段。所用引物為：正向，5′-GTC ACA TTT TCA TTA TTT TTA TTA TAA GG-3′和反向5′-TTT ACC TCT ATT GTT GGA TCA TAT TC-3′。用50 μL的PCR反應(yīng)體系，包括：0.25mmoL的dNTP、0.5 μmoL的引物、0.5單位的Taq DNA聚合酶和1 μL的大片段PCR產(chǎn)物。 PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，先進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：80 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，隨后進(jìn)行15個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃，5 min。

第3步 PCR產(chǎn)物純化測(cè)序，由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果采用COLD-PCR-測(cè)序的方法，檢測(cè)K-ras基因突變狀態(tài)，其代表性結(jié)果如圖1所示。對(duì)COLD-PCR產(chǎn)物測(cè)序的代表性圖譜，指示胃癌患者K-ras基因第12位密碼子由GGT突變?yōu)镚AT。

圖1　　COLD-PCR產(chǎn)物測(cè)序的代表性圖譜

2.2不同標(biāo)本類型胃癌患者K-ras基因的突變情況本研究檢測(cè)了314例胃癌患者，K-ras基因總體突變率是7.32%。包括19例血漿標(biāo)本和295例組織標(biāo)本，血漿標(biāo)本的突變率為0%，組織標(biāo)本的突變率為7.80%，突變類型包括G12D、G13D、G12V，兩種不同標(biāo)本之間K-ras基因的突變率并無(wú)顯著差異(P=0.206 1)，詳見表1。

2.3不同性別胃癌患者K-ras基因的突變情況K-ras基因在221例男性患者的突變率為6.79%，突變類型包括G12D、G13D，在93例女性患者的突變率為8.60%，突變類型包括G12D、G13D、G12V，不同性別之間K-ras基因的突變率之間無(wú)顯著差異(P=0.573 1)，詳見表1。

2.4不同年齡群體胃癌患者K-ras基因的突變情況K-ras基因在45例青年人患者的突變率為6.67%，突變類型包括G12D、G13D，127例中年人患者的突變率為7.87%，突變類型包括G12D、G13D、G12V，142例老年人患者的突變率為7.04%，突變類型包括G12D、G13D，不同年齡患者K-ras基因的突變率之間無(wú)顯著差異(P=0.995 3)，詳見表1。

表1　　胃癌患者不同標(biāo)本類型、性別、年齡群體中K-ras基因的突變頻率

-：無(wú)數(shù)據(jù)。

3討論

哺乳動(dòng)物ras基因家族包括H-ras、K-ras、N-ras基因，分別編碼H-ras、K-ras、N-ras蛋白，它們具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。Ras蛋白位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，將EGFR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，從而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、運(yùn)動(dòng)，以及轉(zhuǎn)移和血管生成[7]。K-ras基因通常在第12、13和61位密碼子上發(fā)生點(diǎn)突變，這些突變常常激活K-ras癌基因[8]。K-ras基因的突變狀態(tài)和靶向EGFR單克隆抗體的治療效果相關(guān)，K-ras基因突變的患者，不適合愛(ài)必妥治療[9]。

多種方法被用于改進(jìn)檢測(cè)的靈敏度，如變性高效液相色譜(DHPLC)[10]、嵌套等位基因特異性阻滯劑(ASB-)PCR[11]、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)[12]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)[13]、以及擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)等[14]。由于對(duì)設(shè)備的要求簡(jiǎn)單，且靈敏度高，COLD-PCR(在較低的變性溫度-PCR)是當(dāng)前最廣泛使用的方法，它能富集不同的DNA片段，改進(jìn)檢測(cè)的靈敏度[15-16]。

雖然手術(shù)是根治胃癌患者的最好方法，但由于很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是胃癌晚期，因此，化療藥物的使用就顯得很重要，其中多西他賽就是典型，它通過(guò)阻斷細(xì)胞分裂，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的目的[17]，從而提高患者的無(wú)進(jìn)展期和生存期，改善生活質(zhì)量。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗的重要原因，現(xiàn)在已經(jīng)有很多標(biāo)志物可以預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)情況的發(fā)生，比如SOX-2、Beta-catenin等，通過(guò)檢測(cè)它們的表達(dá)，可以較好地預(yù)測(cè)胃癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[18-19]。

K-ras基因突變雖然不能作為胃癌患者的個(gè)體化治療指標(biāo)，但是個(gè)體化醫(yī)療是新興的治療癌癥方法，它結(jié)合了分子生物學(xué)的手段，能更好地針對(duì)每個(gè)人的情況采取量體裁衣的治療，從而縮短治療的時(shí)間、提高生存期、改善患者的生活質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

[1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Ward E and forman D:global cancer statistics[J].Ca Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2]Siegel R.Naishadham D and jemal a:cancer statistics[J].Ca Cancer J Clin,2013,63(1):11-30.

[3]Matsueda S,Graham DY.Immunotherapy in gastric cancer[J].World J Gastroentero,2014,20(7):1657-1666.

[4]李巖．胃癌腫瘤標(biāo)志物及臨床意義[J]．實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2011，8(1)：11-15．

[5]Schubbert S,Shannon K,Bollag G.Bollag ghyperactive ras in developmental disorders and cancer[J].Nat Rev cancer,2007,7(1):295-308.

[6]Benvenuti S,Sartore-Bianchi A,Di Nicolantonio F,et al.Oncogenic activation of the RAS-RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti EGFR antibody therapies[J].Cancer Res,2007,67(6):2643-2648.

[7]Bos JL.Ras oncogenes in human cancer:a review[J].Cancer Res,1989,49(17):4682-4689.

[8]Schubbert S.Shannon K and bollag G:hyperactive Ras in developmental disorders and cancer[J].Nat Rev Cancer,2007,7(4):295-308.

[9]Benvenuti S,Sartore-Bianchi A,Di Nicolantonio F,et al.Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapies[J].Cancer Research,2007,53(19):2643-2648.

[10]Lilleberg SL,Durocher J,Sanders C.Walters K and culver K:high sensitivity scanning of colorectal tumors and matched plasma DNA for mutations in APC,TP53,K-RAS,and BRAF genes with a novel DHPLC fluorescence detection platform[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2004,1022(1):250-256.

[11]Mostert B,Jiang Y,Sieuwerts AM.et al.KRAS and BRAF mutation status in circulating colorectal tumor cells and their correlation with primary and metastatic tumor tissue[J].Cancer Research,2013,73(2):130-141.

[12]Abdul MN,Othman Z,Khalid M,et al.missense mutations in MLH1,MSH2,KRAS,and APC genes in colorectal cancer patients in Malaysia[J].Dig Dis Sci,2012,57(11):2863-2872.

[13]Sinha R,Hussain S,Mehrotra R,et al.Kras gene mutation and RASSF1A,FHIT and MGMT gene promoter hypermethylation:indicators of tumor staging and metastasis in adenocarcinomatous sporadic colorectal cancer in Indian population[J].Plos One,2013,8(4):60142.

[14]Bando H,Yoshino T,Tsuchihara K,et al.KRAS mutations detected by the amplification refractory mutation system-Scorpion assays strongly correlate with therapeutic effect of cetuximab[J].Brit J Cancer,2011,105(3):403-406.

[15]Carotenuto P,Roma C,Cozzolino S,et al.detection of KRAS mutations in colorectal cancer with fast COLD-PCR[J].Intern J Oncol,2012,40(2):378-384.

[16]Pennycuick A,Simpson T,Crawley D,et al.routine EGFR and KRAS mutation analysis using COLD-PCR in non-small cell lung cancer[J].Intern J Clin Pract,2012,66(8):748-752.

[17] Unek IT，Akman T，Oztop I，et a1．Bimonthly regimen of high-dose leucovorin，infusional 5-fluorouracil，docetaxel，and cis-platin(modified DCF)in advanced gastric adenoeareinoma[J]．Gastric Cancer，2013，16(3)：428434.

[18]Kormish JD,Sinner D,Zorn AM.Interactions between SOX factors and Wnt/beta-catenin signaling in development and disease[J].Dev Dyn,2010,239(1):56-68.

[19]Huang J,J LI,Qu Y,et al.The expression of claudin 1 correlates with p-catenin and is a prognostic factor of poor outcome in gastric cancer[J].Int J Oncol,2014,44(4):1293-1301.

·論著·

Analysis of K-ras gene mutation status in 314 Chinese patients with gastric cancer*

PengNanqiu,ZhaoXintai△

(ShanghaiShinesPharmaceuticalsCo.,Ltd.,Shanghai201900,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the mutation status of K-ras gene in the patients with gastric cancer to provide the guidance for the personalized therapy of gastric cancer.MethodsThe nested and Cold-PCR were adopted to analyze the K-ras gene mutation status in 314 cases of gastric cancer.ResultsIn 314 cases of gastric cancer,the total mutation rate of K-ras gene was 7.32%.The mutation rate was 0% in 19 plasma samples and 7.80% in 295 tissue samples.The types of mutation included G12D,G13D,G12V,the mutation rate of K-ras gene had no statistically significant difference between the two kinds of different samples (P=0.206 1);the mutation rate was 6.79% in 221 male patients,the types of mutation included G12D,G13D,the mutation frequency is 8.60% in 221 female patients,the types of mutation include G12D,G13D,G12V,the mutation rate of K-ras gene had no statistically significant difference between different genders (P=0.573 1);the mutation rate was 6.67% in 45 youth patients,the types of mutation included G12D,G13D,the mutation rate was 7.87% in 127 middle age patients,the types of mutation included G12D,G13D,G12V,the mutation rate was 7.04% in 142 old age patients,the types of mutation included G12D,G13D,there was no statistically significant difference among different age patients (P=0.995 3).ConclusionThe mutation rate of K-ras gene is 7.32% in 314 cases of gastric cancer,the main mutation types include G12D and G13D,and the mutation rate of K-ras gene has no significant difference among different samples,between different sexes and among different ages.

Key words:gastric cancer;K-ras;gene mutation status

收稿日期：(2015-07-19)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.003A

文章編號(hào)：1673-4130(2015)24-3514-03

通訊作者△，E-mail:zhaoxintai@shineschina.com.

作者簡(jiǎn)介：彭南求，男，主管檢驗(yàn)技師，主要從事腫瘤個(gè)體化醫(yī)療工作。