孫麗婷，劉 萍，李加肖，李響敏，李海星，劉曉華

（1.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047；2.揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制和促凋亡作用

孫麗婷1，劉 萍2，李加肖1，李響敏1，李海星1，劉曉華1

（1.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047；2.揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

共軛亞油酸；異構(gòu)體；MCF-7；人乳腺癌；細(xì)胞增殖；抑制；促凋亡

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是一組具18個(gè)碳原子，含有共軛雙鍵的多不飽和脂肪酸，是必需脂肪酸亞油酸的同分異構(gòu)體。近年來大量動(dòng)物試驗(yàn)表明，CLA具有抗癌［1］、抗動(dòng)脈粥樣硬化［2］、降低脂肪沉積［3］等重要生理功能。雖然目前國內(nèi)外關(guān)于CLA對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響已做了大量研究工作，但還未見t9，t11-CLA單體抗癌活性的報(bào)道。本文通過比較3種CLA異構(gòu)體——c9，t11-CLA；t10，c12-CLA；t9，t11-CLA對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞生長、凋亡及細(xì)胞周期的影響，以篩選出更有效抗癌的CLA異構(gòu)體。

1 材料

1.1 試劑 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7：北京市腫瘤研究所；t9，t11-CLA（純度98％）：Matreya，USA；c9，t11-CLA，t10，c12-CLA（純度98％）：南昌華興生物科技有限公司。

DMEM培養(yǎng)液、0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液、MTT、 Hoechst 33258熒光染料：北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清：美國Hyclone公司；DNA含量檢測(cè)試劑盒：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器 MCO-18AIC（UV）CO2培養(yǎng)箱：（日本）三洋電機(jī)株式會(huì)社；BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀：美國PE公司；酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices；倒置熒光顯微鏡：重慶光學(xué)儀器廠。

2 方法

2.1 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng) 配制含10％胎牛血清、1 ×105U·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素的DMEM全培養(yǎng)基，在5％CO2和37℃條件下培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，每隔24～48 h更換培養(yǎng)基，常規(guī)消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 CLA溶液的制備 配制濃度為200 mmol·L－1的CLA儲(chǔ)備液，保存于－20℃。用前將其用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋，至終濃度分別為25、50、100和200 μmol·L－1。

2.3 MTT法測(cè)定MCF-7細(xì)胞增殖的抑制活性 取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，接種于96孔板，每孔200 μL（1×104細(xì)胞/孔），培養(yǎng)過夜，按不同濃度（25、50、100、200 μmol·L－1）CLA進(jìn)行藥物干預(yù)24 h。加入MTT（5 g·L－1）20 μL每孔，培養(yǎng)箱中保溫4 h后，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加DMSO 200 μL每孔，置搖床上低速振蕩15 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在490 nm波長處的OD值［4］。另設(shè)陰性對(duì)照組和調(diào)零孔（不加細(xì)胞）。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞抑制率/％＝1－［（藥物組OD值－調(diào)零孔OD值）/（對(duì)照孔OD值－調(diào)零孔OD值）×100％］

2.4 熒光染色觀察MCF-7細(xì)胞凋亡 MCF-7細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，每孔600 μL（5.0×104細(xì)胞·孔－1），細(xì)胞培養(yǎng)過夜后加入不同濃度（0、50、100、200 μmol·L－1）的CLA，48 h后，PBS洗滌細(xì)胞，加10 mg·L－1Hoechst 33258熒光染料染色，37℃孵育8 min，PBS洗滌兩次，超凈工作臺(tái)中避光風(fēng)干后進(jìn)行觀察。

2.5 FCM檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板（每孔3×105細(xì)胞），培養(yǎng)過夜后分別加入終濃度為50、100 μmol·L－1的CLA，48 h后，PBS洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞。參照DNA含量檢測(cè)試劑盒說明書處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀對(duì)樣品進(jìn)行凋亡和周期分析。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，采用One-way ANOVE法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

3 結(jié)果

3.1 CLA對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率 3種CLA單體隨著作用濃度的增加，抑制作用均增強(qiáng)。在≤50 μmol·L－1的濃度時(shí)，t10，c12-CLA對(duì)細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于c9，t11-CLA；在≥100 μmol·L－1時(shí)，c9，t11-CLA對(duì)細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于t10，c12-CLA。t9，t11-CLA在不同濃度下的增殖抑制率均高于其他2種CLA單體（P＜0.05）。

3.2 熒光顯微鏡下觀察MCF-7細(xì)胞凋亡 對(duì)照組的細(xì)胞核呈彌漫性均勻熒光，熒光較弱，實(shí)驗(yàn)組隨CLA濃度增加可見明顯的凋亡細(xì)胞核：細(xì)胞核體積變小，皺縮，呈致密濃染的顆粒塊狀熒光。t9，t11-CLA組在50 μmol·L－1的濃度時(shí)就表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡的作用。

3.3 用流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡率及細(xì)胞周期 3種CLA異構(gòu)體在50和100 μmol·L－1濃度下對(duì)MCF-7細(xì)胞均產(chǎn)生較強(qiáng)的促凋亡作用。其中t9，t11-CLA對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡率分別為28.34％和34.66％，與對(duì)照組相比，分別增加了24.93％和31.25％，細(xì)胞凋亡率呈明顯提高（P＜0.05）。

隨CLA濃度增加，MCF-7細(xì)胞G0/G1期縮短，S期延長，由此可見，CLA可將細(xì)胞阻滯在S期。50和100 μmol·L－1的t9，t11-CLA組的G0/G1期細(xì)胞比率分別下降至53.17％ 和42.72％，S期延長的幅度分別為26.96％和32.63％，呈明顯增加（P＜0.05）。

4 討論

CLA是食物中的天然成分，對(duì)人體無毒副作用。本研究中，應(yīng)用人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為體外模型，用MTT法、熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)c9，t11-CLA，t10，c12-CLA和t9，t11-CLA 3種單體的抗乳腺癌活性及促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡能力進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種CLA異構(gòu)體均可抑制MCF-7細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，t9，t11-CLA在抑制MCF-7細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面是最有效的CLA單體。細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，隨CLA濃度增加，MCF-7細(xì)胞G0/G1期縮短，S期延長，表明CLA可將細(xì)胞阻滯在S期，對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。因此，CLA的抗癌作用可能是通過影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂增殖和誘導(dǎo)凋亡。本研究為今后乳腺癌的預(yù)防與治療研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)在中德聯(lián)合研究院和食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，衷心感謝劉曉華老師、劉萍老師、李響敏老師、李海星老師對(duì)我實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)與幫助，感謝李加肖師妹對(duì)我實(shí)驗(yàn)的幫助?。?/p>

［1］ Rakib M A，Lee W S，Kim G S，et al.Antiproliferative action of conjugated linoleic acid on human MCF-7 breast cancer cells medi-ated by enhancement of gap junctional intercellular communication through inactivation of NF-κB［J］.Evid Based Complement Alter-nat Med，2013，11（33）：1－12.

［2］ Eftekhari M，Aliasghari F，Beigi M A，et al.The effect of conju-gated linoleic acids and omega-3 fatty acids supplementation on lipid profile in atherosclerosis［J］.Adv Biomed Res，2014，3（1）：15－9.

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［4］ 木合布力·阿布力孜，王永波，徐方野，阿布力孜·阿布杜拉.異甘草素和3-甲氧基異甘草素對(duì)人肝癌Bel-7402細(xì)胞的抗癌活性［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2014，30（6）：887－8.

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Effects of conjugated linoleic acid isomers on inhib-iting proliferation of MCF-7 human breast cancer cells and promoting apoptosis

SUN Li-ting1，LIU Ping2，LI Jia-xiao1，LI Xiang-min1，LI Hai-xing1，LIU Xiao-hua1
（1.Sino-German Joint Research Institute，Key Laboratory of Food Science，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.Yangzhou No.1 People’s Hospital，Yangzhou Jiangsu 225009，China）

conjugated linoleic acid；isomer；MCF-7；human breast cancer；cell proliferation；inhibit；promote apoptosis

孫麗婷（1989－），女，碩士生，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：907744588＠qq.com；劉曉華（1973－），男，博士，研究員，通訊作者，E-mail：li-uxiaohua＠ncu.edu.cn

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.058.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.029

A

1001－1978（2016）03－0443－02

R329.24；R329.25；R737.902.2；R916.4；R979.1

2015－09－14，

2015－11－18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 31260373）；江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 2013ZBAB205004）