薛 強(qiáng)，肖亞平，陳玉寶，曾 杰，徐曉玉

（西南大學(xué)藥學(xué)院，中醫(yī)藥學(xué)院，重慶北碚 400715）

梓葛凍干粉針抗腦神經(jīng)血管單元炎癥及氧化損傷

薛 強(qiáng)，肖亞平，陳玉寶，曾 杰，徐曉玉

（西南大學(xué)藥學(xué)院，中醫(yī)藥學(xué)院，重慶北碚 400715）

梓葛凍干粉針；神經(jīng)血管單元；體外模型；缺血性中風(fēng)；神經(jīng)保護(hù)；神經(jīng)元；星形膠質(zhì)細(xì)胞；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

由梓醇和葛根素配伍制成的抗缺血性中風(fēng)新藥——梓葛凍干粉針（injection of lyophilized powder with catalpol and puerarin，C-P），可透過血腦屏障并且是安全的［1－2］，可明顯減少中風(fēng)模型小鼠大腦梗死灶面積［3］。本研究在體外構(gòu)建神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）模型并作氧糖剝奪再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷［4］，觀察C-P對(duì)NVU的整體保護(hù)作用，探討其抗炎和抗氧化機(jī)制，為C-P治療缺血性中風(fēng)提供科學(xué)依據(jù)，也為缺血性中風(fēng)的治療藥物篩選提供一種多細(xì)胞體外研究模式。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)♀、♂SD大鼠購自重慶市中藥研究院，合籠飼養(yǎng)于西南大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物和試劑 梓醇和葛根素（批號(hào)均為20111003）購自石家莊流波白鳥生物科技有限公司，純度均≥98％；C-P由本實(shí)驗(yàn)室研制，批號(hào)20120613；胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)基和B27均購自Gibco；胰蛋白酶、明膠、BSA和L-多聚賴氨酸均購自Sigma；所有抗體均購自中國中杉金橋生物技術(shù)有限公司；所有試劑盒均購自中國上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.3 原代細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠大腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的培養(yǎng)分別參考文獻(xiàn)方法［5－6］。

1.4 NVU模型構(gòu)建及其OGD/R損傷 參考前期方法［4］，星形膠質(zhì)細(xì)胞接種在插入池外側(cè)，4 h后放入培養(yǎng)了2 d神經(jīng)元的6孔板內(nèi)；共培養(yǎng)2 d后，將微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于插入池內(nèi)側(cè)，再共培養(yǎng)3～5 d即建成NVU模型。OGD/R損傷參考前期方法［4］并略作改進(jìn)，將NVU培養(yǎng)基換成無糖培養(yǎng)液放入37℃三氣培養(yǎng)箱缺氧4 h后，再換成含糖培養(yǎng)液，正常條件培養(yǎng)2 h。

1.5 模型損傷成功標(biāo)準(zhǔn)及分組給藥 以跨內(nèi)皮電阻值（TEER）明顯低于正常（P＜0.05）為OGD/R損傷成功依據(jù)。實(shí)驗(yàn)共分5組，正常對(duì)照組細(xì)胞用培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，損傷模型隨機(jī)分為4組：OGD/R組、OGD/R＋C-P 3個(gè)劑量組（49.00、24.50和12.25 mg·L－1）。OGD/R＋C-P組分別在更換無糖培養(yǎng)液和復(fù)糖培養(yǎng)液時(shí)，兩次加入C-P。

1.6 細(xì)胞形態(tài)觀察 用顯微鏡觀察不同組別中3種細(xì)胞的形態(tài)并拍照比較。

1.7 ELISA試劑盒檢測蛋白含量及活性 取各組培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書檢測NO和MDA含量以及LDH和SOD活性。

1.8 Western blot檢測蛋白表達(dá) 裂解并收集各組細(xì)胞裂解液，用SDS-PAGE分離蛋白，檢測TNF-α、NF-κB、IL-6和IL-1β含量。

1.9 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 C-P明顯減輕OGD/R對(duì)細(xì)胞的形態(tài)損傷 與正常對(duì)照組相比，OGD/R組神經(jīng)元胞體明顯縮小，軸突變細(xì)，軸突網(wǎng)絡(luò)密度降低；微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體收縮并有部分脫落。與OGD/R組相比，C-P 24.50和49.00 mg· L－1組神經(jīng)元胞體僅有輕微收縮，軸突及其網(wǎng)絡(luò)無明顯變化；微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體輕微收縮，無細(xì)胞脫落。

2.2 C-P明顯減輕OGD/R對(duì)細(xì)胞的氧化損傷 與正常組相比，OGD/R組MDA和NO含量、LDH活性均明顯增加（P ＜0.01），SOD活性明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，C-P 49.00和24.50 mg·L－1組MDA和NO含量、LDH活性均明顯降低（P＜0.05），SOD活性明顯升高（P＜0.05）。

2.3 C-P明顯抑制促炎癥細(xì)胞因子和NF-κB過表達(dá) 與正常組相比，OGD/R組NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）。與OGD/R組相比，C-P 49.00和24.50 mg·L－1組該4個(gè)蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

缺血性中風(fēng)不僅損傷大腦神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和微血管也有損傷并相互影響，其病理機(jī)制涉及炎癥、氧化應(yīng)激、能量障礙、興奮性氨基酸毒性等。因此，對(duì)NVU進(jìn)行整體保護(hù)已成為治療缺血性中風(fēng)的重要策略［7］。本研究顯示，由梓醇和葛根素配伍制成的C-P可明顯改善OGD/R損傷中NVU細(xì)胞的生長形態(tài)，具有明顯抗炎和抗氧化損傷作用。該研究有助于闡明C-P的多靶點(diǎn)和多細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。

（致謝：感謝西南大學(xué)藥學(xué)院分子藥理實(shí)驗(yàn)室各位老師和同學(xué)的支持與幫助！）

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［2］ 原歡歡，張繼芬，王 琴，等.梓葛凍干粉針的局部刺激性、過敏性、溶血性和急性毒性研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29 （6）：880－1.

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［3］ Liu Y，Xue Q，Li X，et al.Amelioration of stroke-induced neuro-logical deficiency by lyophilized powder of catapol and puerarin ［J］.Int J Biol Sci，2014，10（4）：448－56.

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［5］ Liu Y，Xue Q，Tang Q，et al.A simple method for isolating and culturing the rat brain microvascular endothelial cells［J］.Micro-vasc Res，2013，90（6）：199－205.

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Lyophilized powder of catalpol and puerarin re-duce stroke inflammation and oxidative stress

XUE Qiang，XIAO Ya-ping，CHEN Yu-bao，ZENG Jie，XU Xiao-yu
（College of Pharmaceutical Sciences＆College of Chinese Medi-cine，Southwest University，Beibei Chongqing 400715，China）doi：10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.028

lyophilized powder of catalpol and puerarin；neuro-vascular unit；in vitro model；ischemic stroke；neuroprotection；neurons；astrocytes；brain microvascular endothelial cells

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.056.html

A

1001－1978（2016）03－0442－02

R-332；R282.71；R322.81；R329.24；R743.305.31

2015－10－08，

2015－11－03

國家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（No 81473549）；國家科技重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)資助項(xiàng)目（No 2014ZX09304-306-04）；教育部中央高?；究蒲袑ｍ?xiàng)資助項(xiàng)目（No XDJK2014D023）

薛 強(qiáng)（1974－），男，博士生，研究方向：中藥藥理學(xué)與新藥研發(fā)，E-mail：xueqiang2013＠swu.edu.cn；徐曉玉（1958－），女，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)與新藥研發(fā)，通訊作者，Tel：023-68251679，E-mail：xuxiaoyu＠swu.edu.cn