吳華仙　田廣俊　陳曲波

(廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣州510120)

?

IL-10+調(diào)節(jié)性B細胞在自身免疫性疾病中的研究進展①

吳華仙田廣俊陳曲波

(廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣州510120)

近年來，隨著業(yè)內(nèi)對B細胞研究的不斷深入，一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的B細胞亞群——調(diào)節(jié)性B細胞(Regulatory B cell，Breg)逐漸被認識。類似于調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Treg)，Breg在維持外周免疫耐受的過程中起關鍵作用。1996年人們首次在自身免疫性腦脊髓膜炎的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了Breg，并在隨后的一系列疾病研究中發(fā)現(xiàn)Breg可能由Toll樣受體(TLRs)、CD40L等多種因素刺激活化，通過分泌IL-10、TGF-β等細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。越來越多的研究表明，Breg與炎癥、感染、癌癥、移植及自身免疫性疾病等均具有密切聯(lián)系。本文就Breg與自身免疫病的最新研究進展作一綜述。

1Breg的生物特性

1.1Breg的來源與活化依據(jù)表面CD分子不同將成熟B細胞分為B1細胞和B2細胞。B2細胞主要分布在周圍免疫器官，為通常所指的B細胞，是執(zhí)行體液免疫的主要細胞； B1細胞屬于固有免疫細胞,主要分布在腹腔和胸腔，與機體的免疫調(diào)節(jié)、自身免疫病及B細胞源性腫瘤密切相關，能有效提高對凋亡細胞的清除率[1]。早期研究表明分泌IL-10的Breg(B10)主要來源于腹腔的B1細胞，經(jīng)IL-12的刺激可以產(chǎn)生IL-10。之后，有研究者提出Breg細胞來源于幼稚濾泡型B細胞(Follicular B-cell，F(xiàn)OB)，是經(jīng)CD40及BCR的刺激誘導產(chǎn)生的。Dalwadi[2]則發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制功能的Breg細胞可能來源于邊緣區(qū)B細胞(Marginal zone B-cell，MZ B)或者邊緣區(qū)前體B細胞(Transitional 2 marginal-zone precursor B-cell,T2-MZP)，且進一步指出在Breg發(fā)育活化中Gαi2是不可缺少的 。而隨后的研究證實CD19的表達以及TLRs的刺激也可以誘導Breg的發(fā)育活化[3,4]。也有文獻指出Breg發(fā)育過程中需要在IL-21以及CD40依賴的同源T細胞的刺激下，才具備分泌IL-10的能力[5,6]。Matsumoto等[7]則在EAE小鼠引流淋巴結中指出CD138+漿母細胞是分泌IL-10主要場所，并指出轉錄因子Blimp1與IRF4影響CD138+漿母細胞(B10)調(diào)控功能的發(fā)揮。最新研究發(fā)現(xiàn)分泌IL-35的Breg(IL-35+Breg)主要來源于脾臟的CD138+漿母細胞，同時指出其發(fā)育活化需要TLRs與CD40[8,9]。

1.2Breg的表型盡管對于細胞表面標志認識眾多，但有關Breg獨特的表面標志的研究至今尚不完整。細胞表面標志物對于確定Breg具有關鍵性的作用。在動物和人類體內(nèi)，典型的Breg都具備分泌IL-10并且表達CD19的特性。在小鼠模型中，Breg的表面標記主要有：CD1dhi、CD5+、CD24hi、CD23-、CD93hi、IgDhi、CD138+、CD11blow等。人類Breg表型的確定也主要基于IL-10的分泌，它在表型與功能上表現(xiàn)出與小鼠中Breg相似的情況。有關人類Breg的研究主要集中在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)、多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)等自身免疫性疾病。Iwata等[10]在人體研究中發(fā)現(xiàn)Breg主要的表型是CD24hiCD27+。這一群細胞可以通過分泌IL-10，抑制TNF-α的分泌來發(fā)揮免疫抑制功能。同時還發(fā)現(xiàn)了一些其他的Breg表面標記物：CD20、CD21、CD23、CD25、CD27、CD38等。另一文獻報道在SLE患者體內(nèi)主要的Breg表型是CD24hiCD38hi，并證實了這一群B細胞存在功能缺陷[11]。Lindner[12]的研究證實了在實體瘤患者體內(nèi)存在表型為CD19+CD5+GzmB+的B細胞亞群，可以抑制CD4+T細胞的增殖。其他研究還發(fā)現(xiàn)如下Breg表型：CD48hiCD148hi、CD24hiCD148+、CD19+CD5+、CD19+CD24hiCD27int、CD19+CD24hiCD71hi。

1.3Breg的功能及調(diào)節(jié)機制大量體內(nèi)外的Breg的研究都表明：分泌IL-10是Breg發(fā)揮免疫抑制作用的關鍵因素。Breg通過分泌IL-10不僅可以有效地抑制自身反應性CD4+T細胞分泌TNF-α與IFN-γ，而且可以調(diào)控DC細胞的抗原提呈的能力及其他細胞因子的產(chǎn)生。值得注意的是：在體外刺激下，并不是所有的Breg都是通過表達IL-10發(fā)揮調(diào)控作用。Huynh提出[13]：TGF-β是Breg發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的另一途徑，其可以誘導Th1凋亡、抑制APC的抗原提呈能力以及可抑制巨噬細胞的分化。Shen等[8]發(fā)現(xiàn)一群以分泌IL-35進行免疫調(diào)節(jié)作用的Breg(IL-35+Breg)。他們指出IL-35抑制疾病的發(fā)展主要通過調(diào)控T細胞介導的免疫應答以及B細胞的抗原提呈能力。之后Wang等[6,9]的實驗證實IL-35+Breg可以抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性疾病的發(fā)展，并表明IL-35+Breg在自身免疫性疾病宿主免疫發(fā)揮了關鍵的作用。同時他們指出IL-35+Breg的免疫調(diào)節(jié)作用是其受體IL-12Rβ2、IL-27Rα通過激活STAT3/STAT1信號通路實現(xiàn)的。

CD80與CD86是Breg表面的一對共刺激分子，是Breg與細胞相互接觸發(fā)揮免疫抑制作用的重要因素。它們通過與靶細胞表面的細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA4)或CD28的相互作用，對Treg的活化相當重要。在EAE小鼠模型中，Breg表面表達的CD80與CD86對于聚集FOXP3+Treg細胞進入脊髓細胞發(fā)揮免疫抑制作用具有明顯的影響[14]。Breg 還可通過CD40、B7-2 通路抑制效應性T 細胞增殖,從而發(fā)揮免疫抑制功能。此外，Ray[15]提出腫瘤壞死因子相關受體配體(GITRL)、程序凋亡因子1(PD-1)及其受體PD-1L、FasL等在Breg發(fā)揮負向免疫調(diào)節(jié)作用具有一定的作用?？傊珺reg的免疫負調(diào)控的作用的發(fā)揮是多途徑的，但其具體的作用機制還有待進一步的研究[10,16]。

2Breg與自身免疫性疾病

2.1Breg與實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(Exper-imental autoimmune encephalomyelitis， EAE)EAE是一種由T細胞介導的以中心神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病。EAE小鼠模型主要是模擬人類MS。近年研究發(fā)現(xiàn)，B細胞缺失的EAE小鼠的病情惡化更為嚴重，并且通過將野生型小鼠的B細胞與缺乏分泌IL-10功能的B細胞分別過繼轉移到B細胞缺失的EAE小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)過繼轉移野生小鼠的B細胞可以改善病情。此結果證實了IL-10是抑制EAE病情的主要因素。Matsushita[17]的研究發(fā)現(xiàn)早期過繼轉移B10可以直接抑制EAE的病情發(fā)展，降低EAE的發(fā)病率；然而，晚期過繼轉移并不會出現(xiàn)抑制的情況。Ray等[18]在EAE小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)B細胞缺失小鼠體內(nèi)的Treg數(shù)量明顯減少，表明EAE中的Breg可能通過調(diào)節(jié)Treg來維持免疫耐受。此外，他們還指出在EAE中Breg發(fā)揮免疫抑制功能并不依賴B7的表達以及IL-10的分泌。

2.2Breg與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)NZB/WF1與MRL.Fas(lpr)是典型的SLE的小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)CD19基因敲除的NZB/WF1(CD19-/-NZB/WF1)小鼠的病情較野生型的更為嚴重，蛋白尿以及腎小管腎炎都有所增加，并且存活率也呈下降趨勢[19]。他們在實驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過繼轉移CD1dhiCD5+B細胞后，CD19-/-NZB/W F1小鼠的存活率明顯增加，而且小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+Treg比例明顯增加。為此，研究者提出Breg還可以通過誘導Treg的產(chǎn)生抑制SLE的進展。而在SLE的另一個小鼠模型—MRL.Fas(lpr)中，研究者發(fā)現(xiàn)B細胞分泌的IL-10并沒有抑制反應性B、T細胞活化的功能[20]。2010年Blair等[11]指出：在SLE患者外周血中,CD19+CD24hiCD38hiB細胞的負向免疫調(diào)節(jié)作用缺失。經(jīng)過CD40的刺激，CD19+CD24hiCD38hiB細胞可以通過分泌的IL-10抑制Th1的分化。同時，他們也指出在SLE患者中的CD19+CD24hiCD38hiB細胞可能由于STAT3的低磷酸化，從而導致其抑制功能低下。同時，Gao也指出[21]： CD19+FSChiB細胞在SLE患者中的免疫調(diào)節(jié)功能缺失，而在其他的免疫疾病中還具備一定的調(diào)節(jié)功能。為此，研究者提出在SLE患者體內(nèi)誘導Breg的活化機制存在缺陷。

2.3Breg與類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)膠原誘導關節(jié)炎(Collagen induced arthritis，CIA)小鼠是類風濕性關節(jié)炎的典型小鼠模型，此類小鼠主要是在體內(nèi)注射了完全弗氏佐劑從而破壞小鼠的軟骨及骨骼，導致其爪子的腫脹。早期研究表明在B細胞耗竭前，膠原蛋白誘導的免疫可以延遲疾病的發(fā)生、抑制抗體的產(chǎn)生以及顯著減低疾病的嚴重程度；而在B細胞耗竭后，膠原蛋白誘導的免疫對于關節(jié)炎的進展與疾病的嚴重程度并沒有明顯的影響。Carter等[22]在B10細胞缺失的關節(jié)炎小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IL-17以及IFN-γ上升，小鼠的病情進一步惡化。在早期關節(jié)炎的小鼠體內(nèi)過繼轉移體外誘導激活的CD5+CD1dhiB細胞，小鼠關節(jié)炎的嚴重程度降低，病情發(fā)展延遲，并且小鼠體內(nèi)CD4+T細胞分泌IL-17的量也顯著下降[23]。也有研究直接指出由Breg分泌的IL-10在抑制CIA病情的發(fā)展中發(fā)揮著關鍵的作用[24]。Cui等[25]發(fā)現(xiàn)在RA患者體內(nèi)CD19+CD5+CD1dhiB細胞比例下降，它與疾病的活動性評分呈負相關，可以影響疾病的活動性。

2.4Breg與炎癥性腸炎( Inflammatory bowel disease，IBD)IBD包括克羅恩病(Crohn's disease，CD)、潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)等疾病，主要是由Th2細胞針對共生微生物區(qū)系的免疫反應導致的腸道黏膜組織異常。早期有關B細胞的免疫調(diào)節(jié)功能主要在IBD的小鼠模型上研究的。1997年Mizoguchi等在TCRα-/-小鼠的腸系膜淋巴結中發(fā)現(xiàn)了一群可以上調(diào)CD1d、分泌IL-10的B細胞，并發(fā)現(xiàn)其可以抑制疾病的發(fā)展。有研究顯示，在葡聚糖硫酸酯鈉(Dextran sulfate sodium，DSS)誘導的急性結腸炎小鼠的脾臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一群B10細胞—CD5+CD1dhi，可以緩解結腸炎的發(fā)展[26,27]。Yanaba等[28]將CD5+CD1dhiB細胞過繼轉移到DSS誘導的結腸炎小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠通過分泌IL-10預防體重的下降及腸道的出血，病情得到很大程度的改善。2014年Akihiko[29]提出CD患者的B細胞經(jīng)體外刺激培養(yǎng)，其分泌IL-10的量較正常對照組的少，并指出CD患者體內(nèi)的Breg細胞存在著功能缺失，但是沒有明確指出此功能缺失是否直接導致疾病的發(fā)展。

2.5Breg與 I 型糖尿病(Type 1 diabetes ,T1D)非肥胖型糖尿病(Nonobese diabetic，NOD)能自然發(fā)展為T細胞介導的免疫反應，破壞胰島β細胞，最終形成T1D，是研究T1D的主要模型。NOD小鼠主要在13～15周開始發(fā)病，將近80%的雌性小鼠以及20%的雄性小鼠在30周時可發(fā)展為T1D[23]。早期研究者將激活后的B細胞過繼轉移到具有前驅(qū)糖尿病癥狀的NOD小鼠體內(nèi)，可以抑制自發(fā)性Th1細胞免疫應答，延遲糖尿病的發(fā)病。進一步研究發(fā)現(xiàn)激活的B細胞可以維持NOD小鼠體內(nèi)的免疫耐受，延緩疾病的發(fā)展，并指出Breg的免疫調(diào)節(jié)功能主要作用在疾病的早期。他們在NOD小鼠的4～5周時過繼轉移活化的B細胞，可以延緩疾病的發(fā)生，甚至降低疾病的發(fā)病率；而在第9周以后過繼轉移B細胞則只能延緩疾病的發(fā)生[30]。值得注意的是，B細胞分泌的IL-10對于NOD小鼠疾病的發(fā)展具有關鍵的作用。有研究指出：過繼轉移IL-10基因敲除的B細胞，NOD小鼠的發(fā)病率以及胰島的炎癥并沒有呈現(xiàn)下降的趨勢。同時，Kleffel等[31]研究發(fā)現(xiàn)在T1D患者外周血中，IL-10+及CD40+B細胞的比例下降，并且外周血中的B細胞并沒有免疫調(diào)節(jié)的特性[31]。總之，上述的研究都表明Breg可以通過下調(diào)Th1細胞的免疫應答或者分泌抑制性細胞因子預防T1D疾病的發(fā)生發(fā)展。

3結語

Breg作為一群新型具有免疫負調(diào)節(jié)功能的B細胞亞群，已引起免疫學界廣泛關注。盡管近年越來越多的研究集中在Breg上，但有關Breg的諸多問題尚有待進一步的研究: 抗原刺激和BCR信號是小鼠Breg功能形成必不可少的因素，但具體是何種抗原可以促進Breg的發(fā)展仍不清楚； 還有，TLRs、CD40、CD80/CD86等都參與Breg的活化,但并不知道是否還有其他重要的共刺激分子或細胞因子參與此過程；再者，IL-10是Breg發(fā)揮負向調(diào)節(jié)功能的關鍵因素，但對于Breg分泌的IL-10，其具體是如何發(fā)揮作用的，是否由特定的轉錄因子表達，對自身抗原的免疫耐受是暫時的還是長期的等等。隨著這些問題的解決，相信Breg細胞將會為臨床治療人類免疫性疾病提供全新的思路與策略。

參考文獻：

[1]Hardy RR.B-1 B cell development[J].J Immunol,2006,177(5): 2749-2754.

[2]Dalwadi H,Wei B,Schrage M,etal.B cell developmental requirement for the G alpha i2 gene[J].J Immunol,2003,170(4): 1707-1715.

[3]Yanaba K,Bouaziz JD,Matsushita T,etal.The development and function of regulatory B cells expressing IL-10 (B10 cells) requires antigen receptor diversity and TLR signals[J].J Immunol,2009,182(12): 7459-7472.

[4]Dilillo DJ,Matsushita T,Tedder TF.B10 cells and regulatory B cells balance immune responses during inflammation,autoimmunity,and cancer[J].Ann N Y Acad Sci,2010,1183: 38-57.

[5]Yoshizaki A,Miyagaki T,Dilillo DJ,etal.Regulatory B cells control T-cell autoimmunity through IL-21-dependent cognate interactions[J].Nature,2012,491(7423): 264-268.

[6]Egwuagu CE,Yu CR.Interleukin 35-Producing B Cells (i35-Breg): A New Mediator of Regulatory B-Cell Functions in CNS Autoimmune Diseases[J].Crit Rev Immunol,2015,35(1): 49-57.

[7]Matsumoto M,Baba A,Yokota T,etal.Interleukin-10-producing plasmablasts exert regulatory function in autoimmune inflammation[J].Immunity,2014,41(6): 1040-1051.

[8]Shen P,Roch T,Lampropoulou V,etal.IL-35-producing B cells are critical regulators of immunity during autoimmune and infectious diseases[J].Nature,2014,507(7492): 366-370.

[9]Wang RX,Yu CR,Dambuza IM,etal.Interleukin-35 induces regulatory B cells that suppress autoimmune disease[J].Nat Med,2014,20(6): 633-641.

[10]Iwata Y,Matsushita T,Horikawa M,etal.Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells[J].Blood,2011,117(2): 530-541.

[11]Blair PA,Norena LY,Flores-Borja F,etal.CD19(+)CD24(hi)CD38(hi) B cells exhibit regulatory capacity in healthy individuals but are functionally impaired in systemic Lupus Erythematosus patients[J].Immunity,2010,32(1): 129-140.

[12]Lindner S,Dahlke K,Sontheimer K,etal.Interleukin 21-induced granzyme B-expressing B cells infiltrate tumors and regulate T cells[J].Cancer Res,2013,73(8): 2468-2479.

[13]Huynh ML,Fadok VA,Henson PM.Phosphatidylserine-dependent ingestion of apoptotic cells promotes TGF-beta1 secretion and the resolution of inflammation[J].J Clin Invest,2002,109(1): 41-50.

[14]Mauri C,Bosma A.Immune regulatory function of B cells[J].Annu Rev Immunol,2012,30: 221-241.

[15]Ray A,Wang L,Dittel BN.IL-10-independent regulatory B-cell subsets and mechanisms of action[J].Int Immunol,2015.

[16]Flores-Borja F,Bosma A,Ng D,etal.CD19+CD24hiCD38hiB cells maintain regulatory T cells while limiting TH1 and TH17 differentiation[J].Sci Transl Med,2013,5(173): 123r-173r.

[17]Matsushita T,Horikawa M,Iwata Y,etal.Regulatory B cells (B10 cells) and regulatory T cells have independent roles in controlling experimental autoimmune encephalomyelitis initiation and late-phase immunopathogenesis[J].J Immunol,2010,185(4): 2240-2252.

[18]Ray A,Basu S.Regulatory B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)[J].Methods Mol Biol,2014,1190: 243-255.

[19]Watanabe R,Ishiura N,Nakashima H,etal.Regulatory B cells (B10 cells) have a suppressive role in murine lupus: CD19 and B10 cell deficiency exacerbates systemic autoimmunity[J].J Immunol,2010,184(9): 4801-4809.

[20]Teichmann LL,Kashgarian M,Weaver CT,etal.B cell-derived IL-10 does not regulate spontaneous systemic autoimmunity in MRL.Fas(lpr) mice[J].J Immunol,2012,188(2): 678-685.

[21]Gao N,Dresel J,Eckstein V,etal.Impaired suppressive capacity of activation-induced regulatory B cells in systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheumatol,2014,66(10): 2849-2861.

[22]Carter NA,Rosser EC,Mauri C.Interleukin-10 produced by B cells is crucial for the suppression of Th17/Th1 responses,induction of T regulatory type 1 cells and reduction of collagen-induced arthritis[J].Arthritis Res Ther,2012,14(1): R32.

[23]Yang M,Rui K,Wang S,etal.Regulatory B cells in autoimmune diseases[J].Cell Mol Immunol,2013,10(2): 122-132.

[24]Salinas G F,Braza F,Brouard S,etal.The role of B lymphocytes in the progression from autoimmunity to autoimmune disease[J].Clin Immunol,2013,146(1): 34-45.

[25]Cui D,Zhang L,Chen J,etal.Changes in regulatory B cells and their relationship with rheumatoid arthritis disease activity[J].Clin Exp Med,2014.

[26]Schmidt EG,Larsen HL,Kristensen NN,etal.B cells exposed to enterobacterial components suppress development of experimental colitis[J].Inflamm Bowel Dis,2012,18(2): 284-293.

[27]Nishida A,Lau CW,Mizoguchi E,etal.Regulatory B cells in mouse models of intestinal inflammation[J].Methods Mol Biol,2014,1190: 227-241.

[28]Yanaba K,Yoshizaki A,Asano Y,etal.IL-10-producing regulatory B10 cells inhibit intestinal injury in a mouse model[J].Am J Pathol,2011,178(2): 735-743.

[29]Oka A,Ishihara S,Mishima Y,etal.Role of regulatory B cells in chronic intestinal inflammation: association with pathogenesis of Crohn's disease[J].Inflamm Bowel Dis,2014,20(2): 315-328.

[30]Kalampokis I,Yoshizaki A,Tedder TF.IL-10-producing regulatory B cells (B10 cells) in autoimmune disease[J].Arthritis Res Ther,2013,15(Suppl 1):S1.

[31]Kleffel S,Vergani A,Tezza S,etal.Interleukin-10+regulatory B cells arise within antigen-experienced CD40+B cells to maintain tolerance to islet autoantigens[J].Diabetes,2015,64(1): 158-171.

[收稿2015-07-13修回2015-10-20]

(編輯張曉舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.034

作者簡介：吳華仙(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事自身免疫病發(fā)病機制的研究，E-mail:691273246@qq.com。 通訊作者及指導教師：陳曲波(1964年-)，男，主任技師，主要從事自身免疫性疾病發(fā)病機制及其實驗室診斷研究，E-mail:qubochen326@126.com。

中圖分類號R392

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1077-04

①本文為廣東省科技計劃項目[2013(137)-165]、廣東省自籌經(jīng)費類科技計劃項目[20162C0099]、廣東省中醫(yī)院院內(nèi)專項[2015KT1468]。