戴啟心，　宋　偉，　張潤(rùn)錦，　王　愷，　鄒書兵

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，南昌 330006)

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褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響*

戴啟心，宋偉，張潤(rùn)錦，王愷△，鄒書兵△

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，南昌 330006)

[摘要]目的： 探討褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響。方法: 將HSC-T6細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及藥物組，用不同濃度的褐藻素培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞。采用CCK-8檢測(cè)在24 h、48 h和72 h褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞活力變化的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，Western blot法分別檢測(cè)Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)。結(jié)果: 與空白對(duì)照組相比，CCK-8檢測(cè)的結(jié)果表明，褐藻素在一定濃度范圍內(nèi)(15～75 μmol/L)內(nèi)能顯著抑制HSC-T6細(xì)胞的活力(P<0.01)，呈劑量和時(shí)間依賴性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，24 h后高濃度(60 μmol/L)組對(duì)HSC-T6細(xì)胞周期影響的效果顯著(P<0.01)，G1期比例顯著下降(P<0.01)，G2期和S期的比例顯著升高(P<0.01)，48 h后低濃度(15 μmol/L)和中濃度(30 μmol/L)組對(duì)HSC-T6細(xì)胞周期的阻滯作用增強(qiáng)，呈劑量依賴性(P<0.05)；低、中、高濃度組早期凋亡率和總凋亡率都顯著升高，呈劑量依賴性(P<0.05)。蛋白印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低、中、高濃度組Bax的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，中、高濃度組Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論: 褐藻素可以通過(guò)使細(xì)胞周期阻滯于S期和G2期而抑制HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)；同時(shí)能通過(guò)下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax的表達(dá)而誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]褐藻素； HSC-T6細(xì)胞； 細(xì)胞活力； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞凋亡； Bcl-2； Bax

肝纖維化常繼發(fā)于肝臟慢性炎癥性損傷，而在慢性炎癥階段，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)持續(xù)激活后分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，以至于其合成與分解代謝失衡而過(guò)度沉積于肝臟，是肝纖維化發(fā)展中的關(guān)鍵因素[1]。因此，抑制肝星狀細(xì)胞的活化與增殖是治療肝纖維化的重要策略[2]。HSC-T6細(xì)胞是雄性SD大鼠肝臟分離培養(yǎng)后，具有活化HSC的表型，有快速增殖及穩(wěn)定傳代的能力，常被用作于肝纖維化研究的對(duì)象[3]。而褐藻素(fucoxanthin,Fu)是可食用藻類中提取出的一種天然類胡蘿卜素，具有抗炎反應(yīng)及促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞凋亡等作用[4]，本研究采用HSC-T6細(xì)胞系，研究褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡的影響，并探討其抗纖維化的作用機(jī)制。

材料和方法

1材料

大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購(gòu)自湘雅細(xì)胞庫(kù)；褐藻素購(gòu)自Sigma；胎牛血清購(gòu)自Biological Industries；RPMI-1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶(不含EDTA)購(gòu)自Solarbio；CCK-8試劑盒、胰蛋白酶(含EDTA)和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自西隴化工股份有限公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD；Bcl-2和Bax兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)自Proteintech。

2方法

2.1褐藻素存儲(chǔ)液的配制褐藻素粉末按15 mmol/L溶解于無(wú)水乙醇中，-20 ℃避光保存。使用時(shí)用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

2.2HSC-T6培養(yǎng)與分組HSC-T6復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清及雙抗(1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、飽和空氣濕度和5%CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)置空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組，不同濃度(15、30、45、60和75 μmol/L)藥物組。

2.3CCK-8法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞的活力 收集對(duì)數(shù)期HSC-T6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，鋪板細(xì)胞密度為每孔1×104濃度接種于96孔板。隔夜細(xì)胞貼壁，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度褐藻素處理24 h、48 h和72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，在孵育箱中繼續(xù)染色2 h后在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處各孔吸光度(A)值。每組5復(fù)孔，計(jì)算各組的平均值。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期收集對(duì)數(shù)期HSC-T6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，鋪板細(xì)胞密度為每孔8×105濃度接種于6孔板中。隔夜細(xì)胞貼壁，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度褐藻素處理24 h后，用胰酶(不含EDTA)消化并收集細(xì)胞，用PBS洗滌1次。于70%乙醇中4 ℃固定2 h后，1 200 r/min離心5 min，棄去乙醇，并用PBS洗滌2次。用RNA酶100 μL混勻，37 ℃水浴30 min，后加入碘化丙啶 (propidium iodide，PI) 400 μL染色懸浮細(xì)胞，在避光、4 ℃孵育30 min，在流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率收集對(duì)數(shù)期HSC-T6細(xì)胞，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，以每孔8×105接種于6孔板中。設(shè)定不同實(shí)驗(yàn)組，隔夜細(xì)胞貼壁，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度褐藻素處理24 h后，用胰酶(不含EDTA)消化并收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，100 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞后，分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI并使其混勻，室溫、避光的條件下孵育15 min，再加入400 μL 1×binding buffer后于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.6Western blot法檢測(cè)褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響采用蛋白抽取液分別提取空白對(duì)照組和藥物組細(xì)胞的總蛋白，全自動(dòng)生化分析儀(Beckman)測(cè)定蛋白濃度。取30 μg細(xì)胞總蛋白經(jīng)5×上樣緩沖液和30 g/L SDS配平蛋白至同體積后進(jìn)行100 g/L SDS-PAGE,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以50 g/L脫脂奶粉常溫封閉150 min，分別用兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗鼠Bax多克隆抗體和兔抗鼠GAPDH單克隆抗體孵育過(guò)夜。洗滌后分別加入HRP-標(biāo)記山羊抗兔II抗，加入底物化學(xué)發(fā)光試劑后X線片曝光，曝光顯影的目的條帶用軟件進(jìn)行半定量分析，以內(nèi)參照為參考標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出目的條帶標(biāo)準(zhǔn)化后的相對(duì)值，以此判斷蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組比較，隨著褐藻素濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度藥物組HSC-T6細(xì)胞的活力明顯受抑制，且不同褐藻素濃度均以72 h抑制HSC-T6細(xì)胞活力的作用最為明顯，這表明褐藻素呈現(xiàn)明顯時(shí)間和劑量依賴性地抑制HSC-T6細(xì)胞的活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。各時(shí)段空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，表明藥物組中最大劑量的乙醇(0.5%乙醇)對(duì)HSC-T6細(xì)胞活力無(wú)影響，見(jiàn)表1。

表1各組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)T6細(xì)胞的增殖情況

Table 1.Comparison of HSC-T6 cell proliferation among different groups at 24 h, 48 h and 72 h by CCK-8 assay (Avalue. Mean±SD.n=3)

**P<0.01vsblank control;#P<0.05,##P<0.01vsFu 15 μmol/L;＊P<0.05,＊＊P<0.01vsFu 30 μmol/L;&&P<0.01vsFu 45 μmol/L;△P<0.05,△△P<0.01vsFu 60 μmol/L.

2褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，各藥物組處理24 h后，與對(duì)照組相比，15 μmol/L和30 μmol/L藥物組變化趨勢(shì)不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而60 μmol/L藥物組G0/G1期細(xì)胞比例明顯下降(P<0.01)，S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯上升(P<0.01)；15 μmol/L組和30 μmol/L組作用48 h后，與對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05)，S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯上升(P<0.05)，且阻滯作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng), 見(jiàn)圖1、表2、表3。

Figure 1.The representative images of the cell cycle of HSC-T6 cells treated with different concentrations of fucoxanthin for 24 h or 48 h. See Table 2 and Table 3 for the quantitative analysis.

圖1褐藻素作用24 h和48 h各組細(xì)胞的周期分布

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsFu 15 μmol/L;＊＊P<0.01vsFu 30 μmol/L.

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsFu 15 μmol/L.

3褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，各藥物組處理24 h后，其早期凋亡率和總凋亡率均顯著升高(P<0.05)，凋亡率隨藥物濃度的增加而升高，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effects of fucoxanthin at different concentrations on the apoptosis of HSC-T6 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的變化

4褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，在各組細(xì)胞處理24 h后，隨著藥物濃度的增加，與對(duì)照組相比，Bax的表達(dá)明顯升高，同時(shí)，中濃度和高濃度的Bcl-2的表達(dá)也明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，而低濃度組的Bcl-2的表達(dá)無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The effects of fucoxanthin at different concentrations on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the HSC-T6 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

討論

隨著對(duì)肝纖維化發(fā)生機(jī)制的不斷了解，研究者發(fā)現(xiàn)各種原因?qū)е碌母渭?xì)胞損傷會(huì)激活靜息狀態(tài)下的肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞，再通過(guò)不斷地自分泌和旁分泌作用，激活更多的肝星狀細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)合成增加以至在肝內(nèi)過(guò)度沉積是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[5]。所以，對(duì)肝纖維化的早期診斷、早期治療不僅可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化，甚至能有效防止肝硬化的發(fā)生。

目前，已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)從藻類植物中提取的化合物具有一定的護(hù)肝作用，但均尚未明確是何種化合物[6-7]。而本實(shí)驗(yàn)中所運(yùn)用的褐藻素亦稱巖藻黃質(zhì)、巖藻黃素，屬于海產(chǎn)類胡蘿卜素，能從一些藻類植物(如裙帶菜、海帶、馬尾藻等)中提取[8]。雖然褐藻素具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)，但是，褐藻素的抗纖維化作用尚無(wú)明確的研究探討。

本實(shí)驗(yàn)就是將褐藻素作用于雌性SD大鼠活化的肝星狀細(xì)胞即HSC-T6細(xì)胞，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，在一定范圍內(nèi)(15 ～75 μmol/L)，各藥物濃度組均存在顯著性差異，隨著褐藻素藥物濃度的增加，HSC-T6細(xì)胞活力明顯受到抑制，呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，而陰性對(duì)照組(乙醇)對(duì)細(xì)胞活力的影響與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，并與乙醇的作用無(wú)關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，低濃度(15 μmol/L)和中濃度(30 μmol/L)組周期變化均不明顯，而高濃度(60 μmol/L)組與前3組比較，G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少，S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯增高，提示高濃度褐藻素作用HSC-T6細(xì)胞周期阻滯于S期和G2/M期。對(duì)于低濃度和中濃度細(xì)胞周期變化不明顯，考慮可能因作用時(shí)間短且藥物濃度較低，致使藥效作用未能完全發(fā)揮所致，所以補(bǔ)充低濃度組和中濃度組作用48 h后，與空白對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少，S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯增高，說(shuō)明隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，褐藻素對(duì)HSC-T6細(xì)胞周期阻滯作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)。初步驗(yàn)證褐藻素可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期而抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖。

Bcl-2蛋白家族是凋亡調(diào)節(jié)中的主要家族之一，其中有20多種參與調(diào)控抑制凋亡和促進(jìn)凋亡的成員，其中抑制凋亡的主要包括Bcl-2、Bcl-w和Boo等，促進(jìn)凋亡的主要包括Bax、Bok和Bad等[9-10]。而本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，各藥物濃度組早期凋亡和總凋亡細(xì)胞均較對(duì)照組有明顯升高，并對(duì)藥物濃度呈劑量依賴性，提示褐藻素誘導(dǎo)T6細(xì)胞凋亡。同時(shí)下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)及上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，因此可初步推測(cè)褐藻素通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá)及上調(diào)Bax表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)T6細(xì)胞的凋亡。這與Liu等[11]聯(lián)合褐藻素和順鉑增強(qiáng)抗腫瘤作用的研究中，增加Bax/Bcl-2的比例來(lái)驗(yàn)證其聯(lián)合作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，以及侯莉莉等[12]研究褐藻素促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡時(shí)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)和上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)結(jié)果均相類似。

綜上所述，褐藻素通過(guò)作用于HSC-T6細(xì)胞周期，使其阻滯于S期和G2期，從而抑制HSC-T6細(xì)胞的生長(zhǎng)；可能通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)同時(shí)上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞的凋亡。提示褐藻素具有一定的抗肝纖維化作用，為進(jìn)一步探討褐藻素抗肝纖維化作用的機(jī)制奠定了一定的分子基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of fucoxanthin on growth and apoptosis of HSC-T6 cells

DAI Qi-xin, SONG Wei, ZHANG Run-jin, WANG Kai, ZOU Shu-bing

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail：neswk@163.com;zousb999@163.com)

[KEY WORDS]Fucoxanthin; HSC-T6 cells; Cell viability; Cell cycle; Apoptosis; Bcl-2; Bax

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of fucoxanthin (Fu) on the growth and apoptosis of HSC-T6 cells. METHODS: HSC-T6 cells were divided into blank control group, negative control group and drug groups (treated with different concentrations of Fu). The cell viability was detected by CCK-8 assay at 24 h, 48 h and 72 h after Fu treatment. The cell cycle distribution and apoptotic rate were analyzed by flow cytometry. The protein expression of Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. RESULTS: Compared with blank control group, the viability of HSC-T6 cells was inhibited by Fu at concentrations of 15～75 μmol/L in a dose- and time-dependent manner (P<0.01). The cell ratio of G1phase was significantly decreased (P<0.01) and the cell ratio of S phase and G2phase was significantly increased (P<0.01) in 60 μmol/L Fu group after 24 h. The cell ratio of G1phase was significantly decreased (P<0.05) and the cell ratio of S phase and G2phase was significantly increased (P<0.05) in 15 μmol/L and 30 μmol/L Fu groups in a dose-dependent manner after 48 h. The early cell apoptotic rates and total cell apoptotic rates were significantly increased in the Fu treatment groups in a dose-dependent manner (P<0.05). The protein expression of Bax was significantly increased in the Fu treatment groups and the protein expression of Bcl-2 was significantly decreased in 30 μmol/L and 60 μmol/L Fu groups (P<0.05).CONCLUSION: Fu inhibits the growth of HSC-T6 cells possiblely via arresting the cell cycle at S phase and G2phase. The apoptosis of HSC-T6 cells induced by Fu might be via down-regulating the protein expression of Bcl-2 and up-regulating the protein expression of Bax.

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)06- 1132- 06

[收稿日期]2015- 11- 23[修回日期] 2016- 03- 22

*[基金項(xiàng)目]江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.20142BAB205045)

通訊作者△Tel: 0791-6259631; E-mail： neswk@163.com; zousb999@163.com

[中圖分類號(hào)]R391.11

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.029