劉紫萍，　李　菁△，　朱偉杰

(暨南大學1醫(yī)學院病理生理學系,2生命科學技術學院， 廣東 廣州 510632)

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絲瓜絡多糖對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響*

劉紫萍1，李菁1△，朱偉杰2

(暨南大學1醫(yī)學院病理生理學系,2生命科學技術學院， 廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 分離提純絲瓜絡多糖，觀察其對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響，并探討其作用機制。方法：采用熱水浸提法和DEAE-cellulose柱層析法對絲瓜絡多糖進行初步分離和提純，并對分離組分進行紅外光譜分析。運用油紅O染色法，觀察絲瓜絡多糖對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響，并通過RT-qPCR觀察3T3-L1前脂肪細胞分化時CCAAT增強子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein β，C/EBPβ)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptors γ，PPARγ)和CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)mRNA的表達情況。結(jié)果：經(jīng)DEAE-cellulose柱層析法分離得到2個多糖組分，絲瓜絡提取物Ⅰ(RLFⅠ)和絲瓜絡提取物Ⅱ(RLFⅡ)，紅外光譜分析結(jié)果表明2個組分均為多糖類物質(zhì)。RLFⅠ具有顯著抑制3T3-L1前脂肪細胞分化及甘油三酯合成的作用(P<0.05)，RLFⅡ則無顯著效應。與對照組相比，RLFⅠ處理組3T3-L1前脂肪細胞C/EBPβ、PPARγ和C/EBPα的mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論：絲瓜絡多糖RLFⅠ具有顯著抑制3T3-L1前脂肪細胞分化的能力，其作用機制可能與下調(diào)脂肪細胞分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ、PPARγ和C/EBPα有關。

[關鍵詞]絲瓜絡； 3T3-L1前脂肪細胞； 細胞分化

絲瓜絡(Retinervusluffaefructus，RLF)是葫蘆科植物絲瓜老熟后去皮和去籽后的維管束，中藥方劑中常用于治療氣血阻滯的胸肋疼痛、筋骨酸痛、乳汁不通、乳癰中通、乳腺炎、水腫等?，F(xiàn)代藥理學研究表明絲瓜絡具有心臟保護、抗炎、抗過敏、抗氧化、降血脂等功能[1-4]。多年來，天然絲瓜的藥用成分、藥用價值一直受到國內(nèi)外學者的重視，我們前期研究發(fā)現(xiàn)絲瓜絡具有降脂、抑制體重增加和抗氧化的功能，但絲瓜絡調(diào)控脂代謝的分子機制尚不清楚。因此，本研究利用陰離子交換柱層析法分離提純絲瓜絡多糖，并觀察絲瓜絡多糖對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響，為絲瓜絡藥用價值的深度開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

材料和方法

1材料、試劑與儀器

3T3-L1 前脂肪細胞株(中科院上海細胞庫)；絲瓜絡(廣州康樂醫(yī)藥連鎖店)；DEAE-cellulose(北京鼎國昌盛生物)；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)、地塞米松(dexamethasone，Dex)、胰島素(insulin)和油紅O均購自Sigma；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco)；胎牛血清(四季青)；RNAiso Plus及RT-qPCR試劑盒(TaKaRa)；引物由上海生工生物公司合成。T6新銳可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(BRVKER)； CFX96實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。

2方法

2.1絲瓜絡多糖的提取絲瓜絡去皮后60 ℃干燥，攪碎成粉末，備用。稱取絲瓜絡干粉1 kg，以1∶40料液比，90 ℃雙蒸水浸提6 h，過濾；濾液減壓濃縮，加入3倍體積的無水乙醇，混勻后4 ℃靜置過夜，1 800 ×g離心20 min取沉淀，依次用無水乙醇、丙酮洗滌沉淀，冷凍干燥，得粗多糖。

2.2苯酚-硫酸法測定絲瓜絡多糖含量用葡萄糖標準品按照苯酚-硫酸法配制標準液[5]，于波長490 nm處測定吸光度值。以葡萄糖標準液濃度C(mg/L)為橫坐標，其A值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，并得到線性回歸方程y=0.053 6x+0.007 6，R2=0.999 6，線性范圍為0～25 mg/L。

2.3DEAE-cellulose柱層析分離粗多糖將DEAE-cellulose預處理后，裝柱(柱長30cm，直徑2.5cm)，蒸餾水平衡3～5個柱體積。稱取100mg粗多糖，溶于10mL蒸餾水，0.45μm濾膜過濾后，上樣。先用300mL蒸餾水沖洗柱子，再用500mL0～1mol/LNaCl溶液梯度洗脫，最后用500mL1mol/LNaCl溶液沖洗。每10mL接1管，流速為1.0mL/min，采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量。根據(jù)洗脫峰合并洗脫液，透析除鹽，減壓濃縮，冷凍干燥后，得到絲瓜絡提取物Ⅰ(RLFⅠ)和絲瓜絡提取物Ⅱ(RLFⅡ)。

2.4絲瓜絡多糖提取物紅外光譜分析分別取1mg的RLFⅠ和RLFⅡ樣品，干燥，與適量溴化鉀(KBr)粉末研磨混合均勻，壓片，采用紅外光譜儀于4 000～400cm-1范圍內(nèi)掃描。

2.53T3-L1前脂肪細胞的培養(yǎng)及誘導分化以含10% 胎牛血清的DMEM作為基礎培養(yǎng)液，將3T3-L1前脂肪細胞置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至不超過80%培養(yǎng)瓶時，傳代培養(yǎng)。誘導分化方法：取對數(shù)生長期的3T3-L1前脂肪細胞，以每孔2×104的密度接種于24 孔板，待細胞長滿孔底，換液后接觸抑制48h，開始加入誘導液A(0.5μmol/LIBMX、1nmol/LDex、10mg/Linsulin及含10% 胎牛血清的DMEM)培養(yǎng)48h，換誘導液B(10mg/Linsulin及含10% 胎牛血清的DMEM)培養(yǎng)48h，此后，每隔48h換基礎培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，直至約80%的前脂肪細胞分化成脂肪細胞。

2.6絲瓜絡多糖提取物對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響取3T3-L1前脂肪細胞以每孔2×104的密度接種于24 孔板，按照2.5方法進行誘導分化。實驗分組為空白組：細胞不進行誘導分化，其它培養(yǎng)條件同陰性對照組；陰性對照組：細胞進行正常誘導分化；RLFⅠ組和RLFⅡ組：自誘導開始，分別加入終濃度為31.1mg/L、500mg/L和1 000mg/L的RLFⅠ，以及終濃度為250mg/L、500mg/L和1 000mg/L的RLFⅡ。

用油紅O染色觀察成熟脂肪細胞內(nèi)甘油三酯的含量[6]，油紅O具有很強脂溶性，能與甘油三酯結(jié)合。待細胞分化至第8天進行油紅O染色，拍照，并采用ImageJ軟件對脂肪細胞進行定量分析。異丙醇處理已染色細胞，將洗脫液的著色程度進行比色，570nm處檢測吸光度值，分析細胞的分化程度。

2.7RT-qPCR檢測脂肪分化相關轉(zhuǎn)錄因子水平的變化取3T3-L1前脂肪細胞以每孔1×105接種于6孔板，樣品處理方法同2.5，待分化至第8天，RNAisoPlus試劑抽提細胞總RNA，按試劑盒說明書對RNA進行純化，在紫外分光光度計上進行RNA定量，用A260/A280比值確定RNA的純度，認為比值在1.8～2.1之間符合純度要求。配置30μLRNA逆轉(zhuǎn)錄體系，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以GAPDH為內(nèi)參照，進行熒光定量PCR。PCR反應條件為95 ℃ 30s;95 ℃10s，60 ℃ 10s，72 ℃ 10s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對PCR結(jié)果進行分析。引物序列見表1。

3統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間差異采用單因素方差分析，方差齊用SNK法，方差不齊用Tamhane’sT2法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1DEAE-cellulose柱層析分離粗多糖

上樣后，依次用蒸餾水、0～1 mol/L NaCl溶液和1 mol/L NaCl溶液沖洗層析柱，得到2個洗脫峰，收集合并洗脫液，透析，濃縮，冷凍干燥后，得到絲瓜絡提取物RLFⅠ和RLFⅡ。如圖1，峰1為蒸餾水洗脫峰，峰2為0～1 mol/L NaCl溶液的梯度洗脫峰，1 mol/L NaCl溶液洗脫時，未出現(xiàn)明顯的洗脫峰。

Figure 1.The DEAE-cellulose elution curve of polysaccharides from RLF. The saccharides contents were detected by phenol-sulfuric acid method. RLFⅠwas eluted by distilled water, and RLFⅡwas eluted by 0～1 mol/L NaCl solution.

圖1絲瓜絡多糖的DEAE-cellulose洗脫曲線

2絲瓜絡提取物的紅外光譜分析結(jié)果

多糖物質(zhì)的特征吸收峰分布于3 600～3 200 cm-1、3 000～2 800 cm-1、1 400～1 200 cm-1和1 200～1 000 cm-1這4個吸收區(qū)域。3 600～3 200 cm-1為O-H伸縮振動峰，3 000～2 800 cm-1吸收峰由C-H伸縮振動引起，1 400～1 200 cm-1的吸收峰由C-H的變角振動引起，1 200～1 000 cm-1是C-O的伸縮振動峰。

RLFⅠ和RLFⅡ的紅外光譜結(jié)果如圖2顯示，在4個特征吸收區(qū)域都出現(xiàn)了吸收峰，說明RLFⅠ和RLFⅡ都是多糖類物質(zhì)，都有O-H和C-H的伸縮振動峰。RLFⅠ在896.737 cm-1處有吸收峰說明含有 β-D-吡喃葡萄糖，RLFⅡ在1 100～1 010 cm-1和957.484 cm-1處均有吸收峰，說明RLFⅡ的單糖殘基存在吡喃環(huán)和呋喃環(huán)。

3油紅O染色法觀察RLF提取物對3T3-L1 前脂肪細胞分化的影響

3T3-L1前脂肪細胞加誘導液(0.5 μmol/L IBMX、1 nmol/L Dex和10 mg/L insulin)及RLFⅠ或RLFⅡ處理，第8天進行油紅O染色。如圖3～4所示，與NC組相比，RLF Ⅰ處理組的成熟脂肪細胞分化率和脂肪細胞內(nèi)甘油三酯的聚集明顯下降，表明RLFⅠ具有抑制3T3-L1前脂肪細胞分化的功能。RLFⅡ處理的細胞與NC組相比，差異無統(tǒng)計學顯著性。

Figure 2.Infrared absorption spectrum of RLF I and RLF II.

圖2RLF的紅外吸收光譜圖

Figure 3.The effect of RLF on the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes into adipocytes by MDI induction for 8 d (oil red O staining,×100). Mean±SD.n=5.*P<0.05vsMDI.

圖33T3-L1前脂肪細胞誘導分化第8天的油紅O染色觀察脂肪細胞分化率

Figure 4.Triglyceride contents in 3T3-L1 pre-adipocytes induced by MDI for 8 d. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDI.

圖4RLFⅠ和 RLFⅡ?qū)?T3-L1前脂肪細胞甘油三酯合成的影響

4RLFⅠ對脂肪細胞分化相關轉(zhuǎn)錄因子表達的影響

RT-qPCR 檢測結(jié)果見圖5。RLFⅠ處理 3T3-L1前脂肪細胞8 d后，脂肪細胞分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ、PPARγ和C/EBPα的mRNA表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),表明RLFⅠ具有下調(diào)脂肪細胞分化過程中相關轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ、PPARγ和C/EBPα的作用。

Figure 5.The mRNA expression of C/EBPβ, PPARγ and C/EBPα in differentiated 3T3-L1 pre-adipocytes determined by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDI.

圖5RLFⅠ對3T3-L1前脂肪細胞分化調(diào)控基因表達的影響

討論

肥胖癥是一種由遺傳因素、社會環(huán)境、個人行為等多種因素引起的慢性代謝性疾病，可誘發(fā)心臟病、2型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暫停等多種疾病，是全球最大的公眾健康問題之一。利用藥物防治肥胖，從而降低心腦血管等疾病的發(fā)病率，具有重要的臨床意義。

肥胖癥是由于體內(nèi)能量的攝取和消耗不平衡，導致機體脂肪病理性堆積，從而引起機體組織功能障礙[7]。脂肪細胞的分化和脂肪的堆積與肥胖的發(fā)生和發(fā)展密切相關[8]，控制脂肪細胞的增加(即控制前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞)和脂肪細胞內(nèi)甘油三酯的過度聚集是治療肥胖的關鍵點，也是藥物作用的重要靶點[9-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)絲瓜絡具有降脂、抑制體重增加和抗氧化的功能，但起作用的活性成分和分子機制尚未清楚。

絲瓜絡的化學成分有多肽、多糖、甙類(皂甙, 強心甙)、有機酸、蒽醌類、酚類、鞣質(zhì)、黃酮、香豆素、萜內(nèi)酯及生物堿等，其中多糖是絲瓜絡的主要成分之一，具較高的含量[11]。本研究利用熱水浸提法和DEAE-cellulose柱層析法提取分離得到RLFⅠ和 RLFⅡ，紅外光譜分析確定這2個組份均為多糖類物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)RLFⅠ中有吡喃環(huán)，RLFⅡ中存在吡喃環(huán)和呋喃環(huán)。多糖類物質(zhì)具有抗腫瘤、免疫抑制、降血糖、降血脂、抗輻射等生物活性[12-13]。目前關于絲瓜絡多糖的生物學效應研究較少，尚未見其參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面的報道。

脂肪細胞的分化是伴隨著嚴密組織性的有絲分裂過程。3T3-L1前脂肪細胞分化成脂肪細胞的過程中，甘油三酯水平顯著升高，可根據(jù)油紅O染色測定觀察到此變化。本實驗結(jié)果顯示：RLFⅠ處理后，成熟脂肪細胞分化率明顯下降，脂肪細胞甘油三酯的合成顯著減少，表明RLFⅠ具有抑制3T3-L1前脂肪細胞分化效應。RLFⅡ?qū)?T3-L1前脂肪細胞分化則無顯著效應。隨后，本研究觀察了RLFⅠ對3T3-L1前脂肪細胞分化相關調(diào)控基因的影響。

脂肪細胞的分化過程由復雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡調(diào)控。主要包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CCAAT增強子結(jié)合蛋白家族(C/EBPs)兩類轉(zhuǎn)錄因子。在分化早期，轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ首先被激活，在分化后期，相繼激活PPARγ和C/EBPα，PPARγ和C/EBPα協(xié)同調(diào)控下游分化基因，促進脂肪合成[14]。有研究發(fā)現(xiàn)C/EBPβ敲除的小鼠存在輕度的脂肪組織發(fā)育缺陷。成熟脂肪基因組研究表明，在終末分化階段，PPARγ 和C/EBPα占全部基因的60%。PPARγ是維持脂肪細胞終末分化的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，敲除PPARγ后，這些分化細胞不能持續(xù)[15]。因此，可特異性調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ、PPARγ和C/EBPα表達的醫(yī)藥植物已成為治療肥胖的目標[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪細胞分化過程中，RLFⅠ處理組C/EBPβ、PPARγ 和C/EBPα的mRNA表達量顯著降低。500 mg/L的RLFⅠ對C/EBPβ的影響最明顯，31.1 mg/L和500 mg/L的RLFⅠ對PPARγ 和C/EBPα mRNA下調(diào)作用最顯著。

本研究結(jié)果表明，絲瓜絡多糖提取物RLFⅠ具有脂代謝調(diào)控作用，RLFⅠ抑制3T3-L1前脂肪細胞分化的分子機制，可能是C/EBPβ基因表達下調(diào)，脂肪分化啟動功能缺陷；PPARγ和C/EBPα基因表達下調(diào)，不能維持脂肪細胞的終末分化，最終減少脂肪細胞的合成。因此，絲瓜絡多糖對于肥胖的防治具有一定應用價值和臨床意義。

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(責任編輯： 林白霜，羅森)

Effects of Retinervus luffae fructus polysaccharides on differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes

LIU Zi-ping1, LI Jing1, ZHU Wei-jie2

(1DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,2SchoolofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tlijing62@126.com)

[KEY WORDS]Retinervusluffaefructus; 3T3-L1 pre-adipocytes; Cell differentiation

[ABSTRACT]AIM: To observe the influence of polysaccharides extracted fromRetinervusluffaefructus(RLF) on the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes and to investigate its mechanism. METHODS: DEAE-cellulose column was used to isolate and purify RLF. The effect of RLF polysaccharides on 3T3-L1 pre-adipocyte differentiation was determined by oil red O staining. The effect of RLF on the mRNA expression of differentiation-related factors C/EBPβ, PPARγ and C/EBPα was detected by RT-qPCR. RESULTS: Two components of polysaccharides named as RLFⅠand RLFⅡ were acquired by DEAE-cellulose column and identified as polysaccharides by infrared absorption spectrum. RLFⅠsignificantly reduced the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes into the adipocytes and the content of triglyceride in the cells (P<0.05). No obvious effect of RLFⅡ was observed. Compared with control group, the mRNA levels of C/EBPβ, PPARγ and C/EBPα in RLFⅠgroup remarkably down-regulated (P<0.05). CONCLUSION: RLFⅠsignificantly inhibits 3T3-L1 pre-adipocyte differentiation into adipocytes. The mechanism might be related to the down-regulation of differentiation-associated factors C/EBPβ, PPARγ and C/EBPα.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1071- 06

[收稿日期]2016- 03- 11[修回日期] 2016- 04- 29

*[基金項目]廣東省中醫(yī)藥管理局資助項目(No. 20112108)；國家中醫(yī)藥管理局三級實驗室開放課題基金資助項目

通訊作者△Tel: 020-85220253; E-mail: tlijing62@126.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.019