阮智通，　底婷婷，　王　燕，　趙京霞，　解欣然，　王明星，　謝湘江，　蒙玉嬌，　李　萍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，銀屑病中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市中醫(yī)研究所，北京 100010)

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養(yǎng)血解毒湯對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損的干預(yù)作用*

阮智通，底婷婷，王燕，趙京霞，解欣然，王明星，謝湘江，蒙玉嬌，李萍△

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，銀屑病中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市中醫(yī)研究所，北京 100010)

[摘要]目的： 觀察養(yǎng)血解毒湯對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損的干預(yù)作用。方法:STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠24只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組，每組6只，采用外用咪喹莫特誘導(dǎo)皮膚銀屑病樣模型。分別觀察皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(psoriasis area and severity index, PASI)，光鏡下觀察皮損組織形態(tài)學(xué)變化和表皮層厚度；采用皮膚水分油分測(cè)試筆檢測(cè)小鼠背部皮膚水分和油分含量；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)皮損中增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志CD3表達(dá)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)皮損Th17類細(xì)胞因子(IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt)mRNA表達(dá)；采用Western blot檢測(cè)皮損STAT3通路蛋白(STAT3、p-STAT3、JAK3、p-JAK3和SOCS3)的表達(dá)水平。結(jié)果: (1)養(yǎng)血解毒湯組PASI評(píng)分明顯低于模型組，HE染色觀察發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯組皮損表皮增生較模型組少，角化不全的細(xì)胞明顯減少，皮膚厚度降低(P<0.01)；(2)養(yǎng)血解毒湯組皮損油分和水分含量均明顯高于模型組(P<0.05)；(3)養(yǎng)血解毒湯組PCNA陽(yáng)性表達(dá)遠(yuǎn)低于模型組(P<0.01)；(4)養(yǎng)血解毒湯組脾臟重量低于模型組(P<0.05)；(5)養(yǎng)血解毒湯組Th17相關(guān)因子(IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt)表達(dá)水平均低于模型組，此外，p-STAT3和p-JAK3表達(dá)量亦低于模型組，而SOCS3的表達(dá)高于模型組。結(jié)論: 養(yǎng)血解毒湯可能通過(guò)抑制STAT3的磷酸化，減少Th17相關(guān)因子(IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt)的分泌，由此改善咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損改變。

[關(guān)鍵詞]銀屑病; 養(yǎng)血解毒湯; 咪喹莫特; STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

銀屑病一種常見(jiàn)的慢性炎癥增生性皮膚病，易復(fù)發(fā)、難治愈，屬于自身免疫性疾病。輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)的活化參與了其中的病理生理過(guò)程，而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號(hào)通路的激活在這一過(guò)程中有重要的作用，是銀屑病發(fā)病過(guò)程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子[1]。養(yǎng)血解毒湯(Yangxue-Jiedu decoction, YXJD decoction)是北京中醫(yī)醫(yī)院在皮膚病名家趙炳南老先生治療銀屑病的經(jīng)驗(yàn)方基礎(chǔ)上優(yōu)化而得，在隨機(jī)對(duì)照的臨床研究證實(shí)該方治療銀屑病血燥證有較好的療效，有效率為67.9%[2]，但其作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)在STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠上，經(jīng)咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣皮損，觀察養(yǎng)血解毒湯對(duì)Th17細(xì)胞活化及STAT3的干預(yù)作用，探究養(yǎng)血解毒湯的作用機(jī)制和藥物靶點(diǎn)，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)，為藥物優(yōu)化和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論支持。

材料和方法

1動(dòng)物

C57BL/6J野生小鼠，體重18～20 g，由華阜康生物科技股份有限公司提供。在無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)三級(jí)動(dòng)物室無(wú)菌飼料喂養(yǎng)。經(jīng)構(gòu)建質(zhì)粒、純化表達(dá)載體、顯微注射后制備STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠模型。離乳3周后剪尾檢測(cè)鑒定。選取STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠24只(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所動(dòng)物房制備)，雌雄各半，體重18～20 g。

2主要試劑

養(yǎng)血解毒湯所含土茯苓、雞血藤、當(dāng)歸、丹參、玄參、板藍(lán)根、草河車、車前子、生地、麥冬等由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，制劑室負(fù)責(zé)質(zhì)量控制，按成人劑量換算為小鼠用量制備水煎劑。咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司)；甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)片購(gòu)自上海信誼藥廠有限公司，使用時(shí)溶于純凈水(1 mg/kg)；兔和鼠二步法檢測(cè)試劑盒、3% H2O2去離子水、DAB顯色液(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體、CD3單克隆抗體(Abcam)；TRIzol總RNA提取試劑(天根生化科技有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR? Premix Ex TaqTMII、ROX plus、DL2000 DNA Marker(TaKaRa)；白細(xì)胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)、IL-17C、IL-22、維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(retinoid acid-related orphan receptor γt,RORγt)和β-actin引物合成(Invitrogen)；山羊抗兔、小鼠IgG(H+L)和GAPDH鼠單抗(天德悅)；蛋白抽提試劑和BCA蛋白定量試劑盒(賽諾博)；STAT3單克隆抗體、磷酸化STAT3(p-STAT3)單克隆抗體、Janus激酶3 (Janus kinase 3,JAK3)單克隆抗體、磷酸化JAK3(P-JAK3)單克隆抗體和細(xì)胞因子信號(hào)阻抑蛋白3 (suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)單克隆抗體(CST)。

3模型制備及分組

參考Leslie等模型制備方法。實(shí)驗(yàn)前24只STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(80 mg/kg)，背部去毛后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組(陽(yáng)性藥物對(duì)照組)。各組小鼠每天拍照,進(jìn)行銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(psoriasis area and severity index，PASI) 評(píng)分，除正常對(duì)照組外各組均在背部皮膚涂抹5%咪喹莫特乳膏42 mg，同時(shí)模型組每天口服純凈水0.2 mL，養(yǎng)血解毒湯組每天口服養(yǎng)血解毒湯水煎劑0.2 mL，甲氨蝶呤組每天口服甲氨蝶呤片水溶液0.2 mL，持續(xù)6 d。第7天檢測(cè)小鼠背部皮膚水分和油分含量，頸椎脫臼處死后取背部皮膚，三等分后分別用于病理組織檢測(cè)、Western blot法檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；取脾臟稱重并記錄。

4檢測(cè)指標(biāo)與方法

4.1皮損大體觀察以及PASI評(píng)分實(shí)驗(yàn)期間每天對(duì)小鼠進(jìn)行拍照和評(píng)分。評(píng)分參考人類PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)給予小鼠相應(yīng)紅斑、鱗屑及浸潤(rùn)增厚程度的積分，將三者積分相加得到總積分。

4.2皮損表皮屏障功能檢測(cè)采用皮膚水分油分測(cè)試筆，在第7天對(duì)小鼠背部皮膚水分和油分進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)。在溫度為20～25 ℃，空氣相對(duì)濕度為40%～60%環(huán)境下，皮膚與測(cè)量?jī)x器緊密接觸，記錄測(cè)量結(jié)果。

4.3皮損病理改變采用蘇木精-伊紅(HE) 染色觀察小鼠皮膚經(jīng)4%甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，經(jīng)HE染色，觀察皮膚組織學(xué)改變，并在400倍鏡下測(cè)量表皮厚度。

4.4皮損角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)取各組小鼠背部皮膚，經(jīng)4%甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋。5 μm厚連續(xù)切片，免疫組化染色觀察PCNA的表達(dá)。石蠟切片經(jīng)脫蠟水化、過(guò)氧化氫孵育，滴加PCNA抗鼠單克隆抗體，DAB顯色后封片。PCNA表達(dá)陽(yáng)性者在表皮基底層見(jiàn)清晰棕黃色顆粒沉積為準(zhǔn)。在400倍鏡下，每例標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察每例標(biāo)本皮膚組織學(xué)改變，記錄5個(gè)不同區(qū)域PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的數(shù)據(jù)。

4.5小鼠脾臟的重量第7天觀察小鼠脾臟組織，電子天平稱取脾臟的重量，并記錄數(shù)據(jù)。

4.6皮損表皮與真皮中CD3的表達(dá)小鼠背部皮膚，經(jīng)4%甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋。5 μm厚連續(xù)切片，免疫組化染色觀察CD3的表達(dá)。過(guò)程同上，采用CD3抗鼠單克隆抗體，DAB顯色后封片。CD3表達(dá)陽(yáng)性者在表皮和真皮見(jiàn)清晰棕黃色顆粒沉積。在400倍鏡下，每例標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察每例標(biāo)本皮膚組織學(xué)改變，記錄5個(gè)視野CD3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的數(shù)據(jù)。

4.7皮損IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt mRNA的檢測(cè)取各組小鼠背部皮膚，采用TRIzol總RNA提取試劑進(jìn)行樣本RNA提取，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，用ABI 7500型熒光定量PCR儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 40 s, 45個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。具體引物序列見(jiàn)表1。

4.8皮損STAT3相關(guān)通路蛋白(STAT3、p-STAT3、JAK3、p-JAK3和SOCS3)表達(dá)取小鼠背部皮膚，采用蛋白抽提試劑盒提取皮損組織蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)電泳、電轉(zhuǎn)、封閉、加入STAT3、p-STAT3、JAK3、p-JAK3、SOCS3和GAPDH單克隆抗體，反應(yīng)信號(hào)經(jīng)Odssey遠(yuǎn)紅外成像儀檢測(cè)，最后換算為灰度值表示。

F: forward; R: reverse.

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1養(yǎng)血解毒湯對(duì)緩解咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損改變

觀察各組小鼠背部皮膚可見(jiàn)：與正常對(duì)照組相比，模型組皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑和浸潤(rùn)，產(chǎn)生類似銀屑病樣皮損。隨著藥物作用的持續(xù)，模型組皮損從第2～3天開(kāi)始出現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，皮損日益嚴(yán)重，紅斑由淡粉色斑點(diǎn)變?yōu)榇竺娣e深紅色斑塊、鱗屑增多增厚、皮膚浸潤(rùn)明顯。養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組皮損與模型組相比同期的皮損癥狀均明顯減輕，皮膚較光滑，鱗屑較少，紅斑色淺，浸潤(rùn)增厚較輕，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Gross observation of mice at day 7 of treatment (A) and PASI scores of mouse skin lesions induced by imiquimod (B). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖1各組小鼠第7天皮損大體表現(xiàn)和各組小鼠皮損PASI評(píng)分趨勢(shì)

HE染色顯示：正常對(duì)照組皮膚表皮層薄，僅2～3層，真皮炎癥細(xì)胞稀疏。模型組表皮增生明顯，表皮層達(dá)到8～10層，伴有角化不全，表皮棘細(xì)胞層增厚，基底細(xì)胞核有絲分裂旺盛，形成類似銀屑病樣的皮損。養(yǎng)血解毒湯組皮損中表皮層較模型組薄，約3～5層，角化不全的細(xì)胞明顯減少，表皮層厚度明顯低于模型組。MTX組的作用與養(yǎng)血解毒湯相似，見(jiàn)圖2。通過(guò)測(cè)量表皮層的垂直厚度發(fā)現(xiàn)：模型組表皮層增厚明顯，約為正常對(duì)照組小鼠表皮厚度的4～5倍，養(yǎng)血解毒湯組表皮增厚程度低，與模型組比較有顯著差異(P<0.01)，養(yǎng)血解毒湯組表皮增厚程度與甲氨蝶呤組相似，見(jiàn)表2。

Figure 2.Histological changes of skin lesions of mice at day 7 of treatment (HE staining,×400). △ indicates parakeratosis.

圖2各組小鼠第7天皮損組織學(xué)改變

表2各組小鼠第7天表皮層厚度比較

Table 2.Comparison of epidermis thickness in skin lesions at day 7 of treatment (μm. Mean±SD.n=6)

**P<0.01vsmodel.

2養(yǎng)血解毒湯可改善咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損表皮屏障功能異常

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠皮膚的水分與油分含量均明顯低于正常對(duì)照組，而養(yǎng)血解毒湯組小鼠皮損明顯改善，油分與水分含量均較模型組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。甲氨蝶呤組皮膚的油分與水分含量與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

3養(yǎng)血解毒湯顯著抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化異常

PCNA陽(yáng)性表達(dá)位于表皮基底細(xì)胞。正常對(duì)照組小鼠皮膚僅基底層細(xì)胞增殖明顯，約1～2層，呈線狀排列；模型組陽(yáng)性細(xì)胞層數(shù)明顯增多，達(dá)到5～6層，而養(yǎng)血解毒湯組著色細(xì)胞表達(dá)少于模型組，約有2～3層，接近甲氨蝶呤組，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3、表4。

表3各組小鼠皮膚第7天油份與水份含量比較

Table 3.Comparison of oil and water components in skin lesions at day 7 of treatment (%. Mean±SD.n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

4養(yǎng)血解毒湯可降低咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠脾的重量

結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組脾重高于空白組(P<0.01)，養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組小鼠脾的重量都低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

Figure 3.PCNA expression of skin lesions at day 7 of treatment (immunohistochemical staining，×400).

圖3各組小鼠治療7 d 皮損PCNA 表達(dá)

表4各組小鼠第7天表皮皮損高倍鏡視野PCNA表達(dá)個(gè)數(shù)

Table 4.Comparison of the number of PCNA under high-power microscope (Mean±SD.n=6)

**P<0.01vsmodel.

5養(yǎng)血解毒湯顯著抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損CD3+T細(xì)胞的表達(dá)

免疫組化染色顯示：正常對(duì)照組小鼠皮膚CD3+T細(xì)胞的表達(dá)水平低于模型組，二者有顯著性差異(P<0.01)，養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組小鼠皮膚CD3+T細(xì)胞的表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

表5各組小鼠第7天脾的重量比較

Table 5.Comparison of the weight of spleen at day 7 of treatment (g. Mean±SD.n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

Figure 4.CD3 expression of skin lesions at day 7 of treatment (immunohistochemical staining，×400).Mean±SD.**P<0.01vsmodel. Arrow indicates positive expression.

圖4各組小鼠治療7 d皮損CD3表達(dá)

6養(yǎng)血解毒湯顯著抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損中Th17類細(xì)胞因子的分泌

經(jīng)咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠銀屑病樣皮損中IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt的相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，而養(yǎng)血解毒湯組小鼠皮損中Th17相關(guān)細(xì)胞因子基因的相對(duì)表達(dá)量均有所降低，見(jiàn)圖5。

7養(yǎng)血解毒湯可顯著抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損中STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示模型組STAT3的表達(dá)量與正常對(duì)照組相似，但p-STAT3和JAK3的表達(dá)量均高于正常對(duì)照組；此外，SOCS3的表達(dá)水平也高于正常對(duì)照組。相對(duì)于模型組，養(yǎng)血解毒湯在p-STAT3、JAK3和p-JAK3的表達(dá)較少，STAT3的表達(dá)水平與模型組相似，SOCS3的表達(dá)水平高于模型組，見(jiàn)圖6。

討論

銀屑病是常見(jiàn)的慢性炎癥增生性皮膚病，易復(fù)發(fā)，可造成全身系統(tǒng)損害，其主要的組織病理學(xué)改變?yōu)榻琴|(zhì)形成細(xì)胞異常增生、角化不全、角化過(guò)度、血管生成和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。銀屑病病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前仍無(wú)特效治療藥物和有效根治方法，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，是國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)關(guān)注的皮膚疾病之一。

大量研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中起著重要作用，其分泌的細(xì)胞因子如IL-17、IL-22等，參與了銀屑病的免疫發(fā)病過(guò)程[3]。在銀屑病血熱證和血瘀證患者中IL-17、IL-22、IL-6的表達(dá)明顯升高[4]，患者外周血中IL-17水平也高于正常對(duì)照組[5]。IL-23誘導(dǎo)小鼠小鼠皮膚可引起IL-17高表達(dá)，產(chǎn)生類似人銀屑病的皮損癥狀[6]。此外臨床觀察發(fā)現(xiàn)使用拮抗IL-17受體的藥物能明顯改善斑塊型銀屑病的臨床癥狀[7]。STATs為胞質(zhì)蛋白家族, 參與將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核內(nèi)[8]。研究發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損中STAT3處于高表達(dá)狀態(tài)，高表達(dá)STAT3通路的K5. STAT3C轉(zhuǎn)基因小鼠可自發(fā)出現(xiàn)類似銀屑病樣皮損改變[9]，另外，STAT3通路可調(diào)控Th17細(xì)胞的分化，進(jìn)而影響銀屑病的發(fā)病進(jìn)程[10]，因此，我們認(rèn)為在銀屑病發(fā)病過(guò)程中，Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子起到重要作用，而STAT3通路則參與Th17細(xì)胞的分化與分泌。

Figure 5.Comparison of the expression of IL-17A, IL-17C, IL-22 and RORγt mRNA in skin lesions at day 7 of treatment. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖5各組小鼠第7天皮損IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt的相對(duì)表達(dá)量

Figure 6.The expression of STAT3, p-STAT3, JAK3, p-JAK3 and SOCS3 in skin lesions at day 7 of treatment. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖6各組小鼠第7天皮損STAT3相關(guān)通路的蛋白表達(dá)量

咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損模型是銀屑病的經(jīng)典動(dòng)物模型之一。咪喹莫特是Toll樣受體激動(dòng)劑，可激活小鼠體內(nèi)的Toll樣受體，啟動(dòng)機(jī)體的炎癥免疫應(yīng)答，產(chǎn)生類似銀屑病樣皮損的表現(xiàn)[11]。我們前期研究[12]發(fā)現(xiàn)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠模型在前8 d的皮損癥狀和病理學(xué)特征以及細(xì)胞因子改變都與銀屑病相似，皮損處Th17細(xì)胞的活化參與了該模型皮損的產(chǎn)生。我們進(jìn)一步轉(zhuǎn)入STAT3基因，觀察STAT3高表達(dá)小鼠在咪喹莫特誘導(dǎo)下銀屑病樣皮損改變，結(jié)果顯示該模型可產(chǎn)生更接近人類銀屑病的改變，例如表皮增殖導(dǎo)致的指狀下沿、角化不全和角化過(guò)度、微膿腫的增多、T淋巴細(xì)胞尤其是Th17細(xì)胞的炎癥浸潤(rùn)和細(xì)胞因子的釋放，此外，該模型皮損中IFN、IL-6和IL-17都高于咪喹莫特誘導(dǎo)的野生型小鼠；同時(shí)IL-4低于誘導(dǎo)的野生型小鼠。這提示咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣的皮損在分子水平、細(xì)胞水平和組織病理改變比單獨(dú)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠皮損模型嚴(yán)重，且靶點(diǎn)明確。盡管該模型不能完全代表典型的血燥證模型，但是對(duì)于中藥的藥理作用環(huán)節(jié)也不失為一個(gè)合適的選擇。

養(yǎng)血解毒湯是由北京中醫(yī)醫(yī)院參考趙炳南老先生寶貴經(jīng)驗(yàn)，聯(lián)合北京地區(qū)的多家醫(yī)院,在深入研究血燥證的基礎(chǔ)上，達(dá)成專家共識(shí)，形成銀屑病血燥證的優(yōu)化方案。臨床研究[13]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用臨床應(yīng)用養(yǎng)血解毒湯治療血燥型銀屑病患者，總有效率達(dá)63.63%，臨床主要癥狀如鱗屑、瘙癢等均得到有效緩解；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[14]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯能改善咪喹莫特誘導(dǎo)的BALB/c小鼠銀屑病樣皮損；這些都提示養(yǎng)血解毒湯治療銀屑病可靠有效。養(yǎng)血解毒湯以養(yǎng)血的雞血藤、解毒的土茯苓為君藥，佐以當(dāng)歸、丹參養(yǎng)血潤(rùn)膚，板藍(lán)根、草河車、玄參祛濕解毒，體現(xiàn)了養(yǎng)血活血、祛濕解毒的主要治則。養(yǎng)血解毒湯中雞血藤性溫，味苦、甘，具有養(yǎng)血活血通絡(luò)的功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)雞血藤中主要含有黃酮類、酚類、三萜及甾醇等類化合物[15]，雞血藤中有效成分黃酮有促進(jìn)造血功能的作用[16]，同時(shí)對(duì)異常免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用[17]，我們的研究還發(fā)現(xiàn)雞血藤黃酮有效部位SSCE具有抗腫瘤作用，與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生線粒體細(xì)胞凋亡有關(guān)[18]，表明雞血藤具有多方面的作用；土茯苓味甘、淡,性平，具有解毒利濕、涼血解毒、祛風(fēng)止痛的功效。其中主要成分有落新婦苷、異落新婦苷、胡蘿卜苷、花旗松素等[19]，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)土茯苓的有效成分落新婦苷可通過(guò)Jak/STAT3信號(hào)通路調(diào)控Th17細(xì)胞的分化，降低IL-17A、IL-10等炎癥因子的分泌，改善咪喹莫特誘導(dǎo)的BALB/c小鼠銀屑病樣皮損[20]；那么養(yǎng)血解毒湯治療銀屑病中的養(yǎng)血、解毒作用是否與中藥及其主要成分對(duì)血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用有關(guān)？

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯可降低銀屑病樣皮損的PASI評(píng)分，說(shuō)明養(yǎng)血解毒湯能改善咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)等典型銀屑病改變。角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖與活化是銀屑病皮損主要病理表現(xiàn)之一，研究中發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯可顯著降低表皮層厚度，PCNA所反映的增殖的細(xì)胞數(shù)減少也提示了養(yǎng)血解毒湯抑制角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖的作用。同時(shí)皮損處皮膚水分和油分含量趨向正常，提示養(yǎng)血解毒湯調(diào)節(jié)了角質(zhì)形成細(xì)胞異常分化，促進(jìn)細(xì)胞角質(zhì)化進(jìn)而維持表皮細(xì)胞的屏障功能。這可能與該方中養(yǎng)血中藥的作用有關(guān)。

目前研究認(rèn)為，角質(zhì)形成細(xì)胞的異常改變主要是由于浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子介導(dǎo)的[21]。實(shí)驗(yàn)中模型組STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠皮損中CD3+T細(xì)胞明顯高于正常，脾臟作為機(jī)體重要的外周免疫器官，在模型小鼠體內(nèi)顯著增大，提示該模型發(fā)生的全身系統(tǒng)免疫反應(yīng)。養(yǎng)血解毒湯可減輕脾臟的重量，降低CD3的表達(dá)量，提示養(yǎng)血解毒湯可減輕STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠全身免疫反應(yīng)，降低皮損處的炎癥程度，由此提示養(yǎng)血解毒湯解毒功效可能與該方抑制機(jī)體，尤其是皮損部位的炎癥程度有關(guān)。Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-17、IL-22等在銀屑病發(fā)病中起到關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯可有效降低IL-17A、IL-17C和IL-22在皮損處的相對(duì)表達(dá)量，提示養(yǎng)血解毒湯的作用機(jī)制可能通過(guò)降低Th17類細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。這也是我們今后將要深入研究的重點(diǎn)。

銀屑病發(fā)病過(guò)程中STAT3通路參與調(diào)控Th17類細(xì)胞因子的分泌，通過(guò)對(duì)STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯減少p-STAT3和p-JAK3蛋白表達(dá)，表明養(yǎng)血解毒湯可一定程度上抑制STAT3通路的異常活化；由于轉(zhuǎn)基因小鼠高表達(dá)STAT3基因，實(shí)驗(yàn)組小鼠皮損中STAT3的表達(dá)量相似；SOCS3是STAT3通路的下游蛋白，可負(fù)調(diào)控STAT3通路的活化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯組SOCS3的表達(dá)顯著高于模型組，提示養(yǎng)血解毒湯可能是通過(guò)促進(jìn)SOCS3的分泌，抑制STAT3通路的磷酸化，降低Th17類細(xì)胞因子的分泌，從而達(dá)到治療銀屑病的目的。

綜上所述，養(yǎng)血解毒湯可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖與分化，改善STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損病理表現(xiàn)；減輕STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠全身免疫反應(yīng)，降低皮損處的炎癥浸潤(rùn)程度；其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制STAT3通路的磷酸化，促進(jìn)SOCS3的分泌，降低Th17類細(xì)胞因子如IL-17A、IL-17C和IL-22的分泌，從而達(dá)到治療銀屑病的目的。另外，養(yǎng)血解毒湯的養(yǎng)血作用可能與保持皮膚組織中水分和油分含量，改善銀屑病皮損屏障功能有關(guān)；解毒作用可能與抑制T淋巴細(xì)胞表達(dá)，降低IL-17A、IL-22和IL-17C的分泌有關(guān)。本研究為臨床使用養(yǎng)血解毒湯治療銀屑病提供理論依據(jù)，為今后進(jìn)一步研究提供證據(jù)與方向。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effects of Yangxue-Jiedu decoction on imiquimod-induced psoriasis-like lesions in STAT3 transgenic mice

RUAN Zhi-tong, DI Ting-ting, WANG Yan, ZHAO Jing-xia, XIE Xin-ran, WANG Ming-xing, XIE Xiang-jiang, MENG Yu-jiao, LI Ping

(BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingKeyLaboratoryofClinicandBasicResearchwithTraditionalChineseMedicineonPsoriasis,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China.E-mail:liping411@126.com)

[KEY WORDS]Psoriasis; Yangxue-Jiedu decoction; Imiquimod; STAT3 signaling pathway

[ABSTRACT]AIM: To observe the effects of Yangxue-Jiedu (YXJD) decoction on imiquimod-induced psoriasis-like lesions inSTAT3 transgenic mice.METHODS:STAT3 transgenic mice (n=24) were randomly divided into 4 groups: control group (using purified water for oral administration), model group (topical 5% imiquimod 42 mg and using purified water for oral administration), YXJD groups (topical 5% imiquimod 42 mg and using YXJD decoction for oral administration), and methotrexate (MTX) group (1 mg/kg MTX solution for oral administration, with the same topical imiquimod as model group). On day 7, the skin lesions were collected for examination. The lesions were evaluated according to the psoriasis area and severity index (PASI). The skin barrier function was evaluated by assessing oil and water components in the skin. The inflammation of psoriasis-like lesions was assessed by histological method. The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and CD3 was assessed by immunohistochemical staining. The mRNA expression of IL-17A, IL-17C, IL-22 and RORγt was detected by real-time PCR. The levels of JAK/STAT3 pathway-related proteins in isolated T cells were determined by Western blot.RESULTS: Administration of YXJD decoction inhibited imiquimod-induced keratinocyte proliferation and infiltration of CD3+T cells in psoriatic lesions, and ameliorated the epidermal barrier by up-regulation of the oil and water components in psoriatic lesions. Meanwhile, administration of YXJD decoction improved the systemic immune responses by reducing the weight of the spleen. The inflammatory cytokines IL-17A, IL-17C, IL-22 and RoRγt, and the levels of JAK/STAT3 pathway-related proteins STAT3, p-STAT3, JAK3 and p-JAK3 were decreased by administration of YXJD decoction.CONCLUSION: YXJD decoction likely alleviates imiquimod-induced psoriasis-like lesions in theSTAT3 transgenic mice by inhibiting the phosphorylation of STAT3, and reducing the expression of IL-17A, IL-17C, IL-22 and RORγt.

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)06- 1091- 08

[收稿日期]2016- 01- 22[修回日期] 2016- 04- 29

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81573974)；北京市科委十病十藥資助項(xiàng)目(No. Z141100002214015)

通訊作者△Tel: 010-52176679; E-mail: liping411@126.com

[中圖分類號(hào)]R275; R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.022