王建飛，　董　旭，　張　毅，　曹　麗，　曹若瓊，　孫陽陽，　王建國，　鐘　理,3△，　王　君，　邊志穎

(河北大學(xué)1生命科學(xué)學(xué)院生物芯片研究室，2附屬醫(yī)院，河北 保定 071002；3Western University of Health Science， Pomona, CA 91766， USA；4保定市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌3科，河北 保定 071002)

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1型糖尿病、2型糖尿病及2型糖尿病伴動脈硬化患者外周血白細(xì)胞端粒長度的研究*

王建飛1，董旭1，張毅1，曹麗1，曹若瓊1，孫陽陽1，王建國2，鐘理1,3△，王君4△，邊志穎4

(河北大學(xué)1生命科學(xué)學(xué)院生物芯片研究室，2附屬醫(yī)院，河北 保定 071002；3Western University of Health Science， Pomona, CA 91766， USA；4保定市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌3科，河北 保定 071002)

[摘要]目的： 檢測1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、2型糖尿病伴動脈硬化(DAS)患者外周血白細(xì)胞端粒長度，分析糖尿病患者端粒長度變化的因素。方法：選擇T1DM患者30例、T2DM患者60例、DAS患者40例和健康對照(NC組)40例，分別提取外周血白細(xì)胞，然后提取基因組DNA進(jìn)行real-time PCR檢測端粒長度。利用多元線性回歸分析影響端粒長度變化的因素。結(jié)果：T1DM組、T2DM組和DAS組的端粒長度均小于NC組(P<0.05)；T1DM組端粒長度短于T2DM組和DAS組；DAS組較T2DM組更短。多元線性回歸分析顯示,T1DM組中，年齡與端粒長度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；T2DM組中，年齡、體重指數(shù)(BMI)與端粒長度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；DAS組中，患病時(shí)間、BMI與端粒長度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：糖尿病患者的外周血白細(xì)胞端粒長度明顯短于正常人，并且T1DM患者端粒長度短于T2DM；在2型糖尿病的對比中，DAS患者的端粒長度明顯短于T2DM?；颊叩哪挲g、患病時(shí)間、BMI與端粒長度的縮短有密切的關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]端粒長度； 糖尿病； 動脈硬化

端粒是由2位著名的遺傳學(xué)家McClintock[1]與Muller[2]最早提出來的，他們發(fā)現(xiàn)染色體的穩(wěn)定性和完整性是由染色體的末端來維持的，并且Muller[2]將其命名為“telomere”。端粒是非常特殊的DNA結(jié)構(gòu)，位于真核細(xì)胞的染色體末端，是由上千段重復(fù)串聯(lián)的DNA序列(TTAGGG)和蛋白質(zhì)所構(gòu)成的，具有保護(hù)DNA不被降解的作用，是DNA復(fù)制過程所必須的結(jié)構(gòu)元件[3]。端粒與細(xì)胞分裂有密切的關(guān)系，隨著細(xì)胞的分裂端粒長度在不斷變短，當(dāng)達(dá)到一定長度，也就宣告了細(xì)胞凋亡，因此，端粒長度常作為細(xì)胞衰老的生物學(xué)標(biāo)志[4]。

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或二者兼有所引起的疾病，體內(nèi)長期的高血糖會引起一系列的并發(fā)癥，例如：心臟、血管、腎臟、眼等的損傷。本研究以1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)以及2型糖尿病伴動脈硬化(diabetes complicated with arterial sclerosis,DAS)患者為研究對象，探討不同分型糖尿病及糖尿病并發(fā)癥對端粒長度的影響；以及年齡、性別、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙、患病時(shí)間等因素對糖尿病患者外周血白細(xì)胞端粒長度的影響。

材料和方法

1臨床資料

收集2014年12月～2015年12月在保定市第一中心醫(yī)院和河北大學(xué)附屬醫(yī)院130例糖尿病患者的外周血液樣本?；颊叽饲安]有接受或者很少接受系統(tǒng)的治療。根據(jù)《內(nèi)科學(xué)(第7版)》 中對于T1DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，選擇T1DM患者30例[包含8例T1DM亞型：成人隱匿性自身免疫性糖尿病(latent autoimmune diabetes in adults，LADA)]，為排除年齡干擾，選擇患者均為成年人，其中男14例，女16例，年齡33～52歲；根據(jù)《2010中國糖尿病指南》中糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇T2DM患者60例，其中男28例，女32例，年齡25～69歲；選擇DAS患者40例，其中男19例，女21例，年齡42～88歲；選取40名健康人作為正常對照(normal control，NC)組，其中男18例，女22例，年齡23～55歲。

2主要試劑與儀器

基因組DNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；2×SYBR Green qPCR Master Mix (DBI)；NanoDrop 2000c分光光度計(jì)(Thermo)；CFX96 熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。

3主要方法

3.1基因組DNA的提取采用血液基因組提取試劑盒提取基因組DNA，NanoDrop 2000c檢測DNA的純度和濃度，選擇A260/A280值為1.80～2.00的DNA樣本；將樣本稀釋成2.5 μg/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2端粒長度檢測運(yùn)用端粒長度比值評估各組的端粒長度，端粒長度比值(T/S比值)即樣本中端粒重復(fù)拷貝數(shù)(T)和單拷貝基因拷貝數(shù)(S)的比值，使用real-time PCR技術(shù)進(jìn)行端粒長度的檢測[6]。端?；虻纳嫌我镄蛄?Telomere-F)為 5’-CGGTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3’,下游引物序列(Telomere-R)為 5’-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3’;內(nèi)參照基因上游引物序列(36B4-F)為 5’-CAGCAAGTGGGAA GGTGTAATCC-3’, 下游引物序列(36B4-R)為 5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’。 PCR 引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR的反應(yīng)體系為2× SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL(引物濃度為 10 mmoL/L)，模板DNA 4 μL，超純水5 μL，擴(kuò)增體系總體積為20 μL。端粒與內(nèi)參照基因的反應(yīng)條件均為 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán);首循環(huán)95 ℃ 10 min，擴(kuò)增反應(yīng)的特異性使用熔解曲線檢驗(yàn)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行4%的瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)一步驗(yàn)證產(chǎn)物特異性(圖1)。實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)樣品均做3個(gè)平行，取平均值作為該樣品的Ct值；精確計(jì)算樣品端粒及內(nèi)參照36B4基因的Ct值，T/S 比率同端粒長度呈正比例關(guān)系，端粒長度就可以根據(jù)T/S來測定。ΔCt=Cttelomere-Ct36B4，相對T/S比率=2-(ΔCt1-ΔCt2)=2-ΔΔCt，ΔCt1為每個(gè)樣品T/S比率，ΔCt2為參考DNA的T/S比率。

Figure 1.PCR product of telomere and reference gene. M: marker; 1, 2: telomere; 3, 4: 36B4.

圖1端粒與內(nèi)參照基因PCR產(chǎn)物

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；不同組間采用方差分析F檢驗(yàn)；對于端粒長度影響因素的分析采用多元線性回歸，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

14組研究對象的基本資料

利用單因素方差分析對研究對象的基本資料進(jìn)行兩兩比較(表1)。在4組比較中性別和吸煙的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而年齡、BMI和患病時(shí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。T1DM、T2DM和DAS的端粒長度均短于NC組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；T1DM端粒長度較T2DM組和DAS組進(jìn)一步縮短，DAS組端粒長度較T2DM組進(jìn)一步縮短，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

*P<0.05vsNC group.

2多元線性回歸分析影響端粒長度的因素

以端粒長度為因變量，性別、年齡、BMI、患病時(shí)間和吸煙為自變量，建立多元線性回歸。

2.1T1DM組多元線性回歸分析對于T1DM組的分析結(jié)果顯示，性別、患病時(shí)間、BMI、吸煙與患者端粒長度沒有相關(guān)性；年齡與端粒長度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，表明年齡越大，端粒長度越短，見表2。

2.2T2DM組多元線性回歸分析對于T2DM組的分析結(jié)果顯示，性別、患病時(shí)間、吸煙與患者端粒長度沒有相關(guān)性；年齡、BMI與端粒長度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，表明年齡越大、BMI值越大，端粒長度越短，見表3。

2.3DAS組多元線性回歸分析對于DAS組的分析結(jié)果顯示，年齡、性別、吸煙與患者端粒長度沒有相關(guān)性；患病時(shí)間、BMI與端粒長度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，表明患病時(shí)間越長、BMI值越大，端粒長度越短，見表4。

討論

近年來，越來越多的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)糖尿病、心臟病、動脈硬化等慢性疾病會影響端粒長度的變化[7-9]，并在2型糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)存在端?？s短的現(xiàn)象[10]，且在動脈硬化等血管病變的患者中也發(fā)現(xiàn)了端?？s短的現(xiàn)象[9, 11-12]。隨著年齡的增長，糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有所提高[13]，是由于年齡的增長會導(dǎo)致胰島素分泌量降低；而且隨著年齡增長，端粒長度也會隨之縮短[4]。

本研究發(fā)現(xiàn)，T1DM組端粒長度短于T2DM組，2組的多元線性回歸分析表明年齡為影響二者端粒減短的原因，而BMI會影響T2DM組的端粒長度。這可能是二者的發(fā)病原因不同所致。T1DM為T細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的自身免疫性疾病，主要發(fā)生在青少年中，可以通過抗體檢測進(jìn)行診斷，并且經(jīng)常伴有酮癥酸中毒現(xiàn)象[14]。T1DM對胰島素多種抗原成分免疫欠耐受，因此導(dǎo)致了針對胰腺B細(xì)胞的自身免疫性破壞，當(dāng)出現(xiàn)糖尿病癥狀的時(shí)候，80%的胰島β細(xì)胞已經(jīng)遭到嚴(yán)重破壞[15]。de Magalh?es等[16]也發(fā)現(xiàn)自身免疫與端粒長度存在比較密切的聯(lián)系，當(dāng)端?？s短之后又會對胰島細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步損傷。所以T1DM是非常嚴(yán)重的糖尿病類型，對其進(jìn)行早期的診斷治療是非常必要的。T2DM是由于胰島素抵抗或者胰島素缺少而發(fā)生的代謝性疾病，多發(fā)生于成年人，T2DM的端粒長度縮短可能是由于氧化應(yīng)激反應(yīng)所致[17]，因?yàn)槎肆８缓镍B嘌呤極易受到氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響而導(dǎo)致端粒長度的縮短[18-19]；而肥胖也是T2DM的標(biāo)志之一，本研究的多元線性分析也表明BMI的增大會導(dǎo)致端粒的縮短，有研究表明，肥胖也是會增加體內(nèi)的氧化應(yīng)激程度[19]，導(dǎo)致胰島細(xì)胞的破壞，產(chǎn)生或加重糖尿病病情。

本研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病當(dāng)患有動脈硬化并發(fā)癥時(shí)，端粒長度會比無并發(fā)癥的2型糖尿病患者的端粒長度要更短，但是仍然長于1型糖尿病患者，表明大血管并發(fā)癥會使端粒進(jìn)一步縮短。通過多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)：患病時(shí)間與BMI會影響患者的端粒長度，通過表1也看出DAS的患病時(shí)間要長于T2DM，隨著糖尿病的病情發(fā)展就會出現(xiàn)一些并發(fā)癥而嚴(yán)重影響人類的身體健康情況。研究表明，細(xì)胞老化是動脈硬化的危險(xiǎn)因素，細(xì)胞的衰老會促進(jìn)血管內(nèi)皮的損傷和動脈血栓的形成[20]；糖尿病對細(xì)胞端粒的損傷會加速細(xì)胞的老化以至于促進(jìn)動脈硬化的形成而危及病人生命。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以本地區(qū)、同等條件下的T1DM、T2DM與DAS患者進(jìn)行外周血白細(xì)胞的端粒長度檢測，3組患者的外周血白細(xì)胞端粒長度均短于正常人，而T1DM組的最短，表明T1DM對人體傷害更為嚴(yán)重；患有并發(fā)癥時(shí)，患者的端粒長度會進(jìn)一步縮短，表明糖尿病并發(fā)癥對患者的傷害非常大，嚴(yán)重影響了患者的生命。由于糖尿病會影響外周血白細(xì)胞端粒長度變化，那么端粒長度可能會成為糖尿病診斷、判斷病情程度的重要分子指標(biāo)。在以后的研究中，對糖尿病其它并發(fā)癥進(jìn)行系統(tǒng)的研究，并且加強(qiáng)對糖尿病患者的跟蹤治療與檢測，進(jìn)行治療前后的端粒長度統(tǒng)計(jì)，能夠系統(tǒng)完善地研究糖尿病對患者端粒長度的影響。希望端粒長度的變化能夠作為檢測病情發(fā)展，并發(fā)癥早期診斷與預(yù)防的重要分子指標(biāo)，在以后的糖尿病治療與研究中能起到重要作用。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Telomere length in peripheral blood leukocytes of T1DM, T2DM and DAS patients

WANG Jian-fei1, DONG Xu1, ZHANG Yi1, CAO Li1, CAO Ruo-qiong1, SUN Yang-yang1, WANG Jian-guo2, ZHONG Li1,3, WANG Jun4, BIAN Zhi-ying4

(1LaboratoryofBiochip,CollegeofLifeSciences，2AffiliatedHospital,HebeiUniversity,Baoding071002,China;3WesternUniversityofHealthScience,Pomona,CA91766,USA;4ThirdDepartmentofEndocrinology,BaodingFirstCentralHospital,Baoding071002,China.E-mail:lee_z@yahoo.com;ztywj5109@163.com)

[KEY WORDS]Telomere length; Diabetes mellitus; Arterial sclerosis

[ABSTRACT]AIM: To test the telomere length of peripheral blood leukocytes in the patients with type 1 diabetes mellitus (T1DM), type 2 diabetes mellitus (T2DM) and T2DM complicated with arterial sclerosis (DAS), and to explore the related mechanism. METHODS: Thirty patients with T1DM, 60 patients with T2DM, 40 patients with DAS and 40 normal controls (NC group) were enrolled in this trial and the peripheral blood leukocytes were isolated to extract DNA for determining telomere length by real-time PCR. Multiple linear regression analysis was performed to analyze the factors changing telomere length. RESULTS: The telomere lengths in T1DM group, T2DM group and DAS group were less than that in NC group (P<0.05), that in T1DM group was shorter than those in T2DM group and DAS group, and that in DAS group was shorter than that in T2DM group. The results of multivariate linear regression analysis showed that age was negatively correlated with telomere length (P<0.05) in T1DM group, age and body mass index (BMI) were negatively correlated with telomere length (P<0.05) in T2DM group, and duration of illness and BMI were negatively correlated with telomere length (P<0.05) in DAS group. CONCLUSION: The telomere length of peripheral blood leukocytes in diabetic patients is shorter than that in normal people, and the telomere length of T1DM patients is shorter than those of T2DM and DAS patients. The telomere length of DAS patients is shorter than that of T2DM patients. The telomere length shortening in diabetic patients is mainly associated with age, duration of illness, and BMI.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1066- 05

[收稿日期]2015- 12- 14[修回日期] 2016- 01- 20

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81272444; No. 81472744)

通訊作者△鐘理 Tel: 0312-5079365; E-mail: lee_z@yahoo.com；王君 Tel: 0312-5976756; E-mail: ztywj5109@163.com

[中圖分類號]R587.1; R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.018