陶娜娜，　周洪鐘，　任吉華，　陳　祥，　李宛蔚，　劉　波，　陳　娟

(重慶醫(yī)科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶 400016)

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Sirtuin 6對肝癌細胞增殖的影響*

陶娜娜，周洪鐘，任吉華，陳祥，李宛蔚，劉波，陳娟△

(重慶醫(yī)科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶 400016)

[摘要]目的： 探究sirtuin 6 (SIRT6)對肝癌細胞增殖的影響。方法: RT-qPCR檢測200例肝癌病人及50例健康人外周血中的SIRT6的mRNA表達水平，并將肝癌病人外周血SIRT6的mRNA表達水平與多個臨床病理參數(shù)相結合進行統(tǒng)計學分析。Western blotting檢測SIRT6在原代肝細胞、永生化肝細胞及肝癌細胞系中的蛋白表達水平。在肝癌細胞中利用shRNA干擾SIRT6基因的表達，并通過Western blotting驗證沉默效率；MTS實驗檢測SIRT6基因沉默對肝癌細胞活力的影響。EdU標記實驗檢測SIRT6基因沉默對肝癌細胞DNA合成的影響；平板集落實驗檢測SIRT6基因沉默對肝癌細胞集落形成能力的影響；軟瓊脂集落形成實驗檢測SIRT6基因沉默對肝癌細胞錨定非依賴生長能力的影響。結果: SIRT6在肝癌病人的外周血中表達明顯增高，且SIRT6的表達量增高與腫瘤的大小、腫瘤的分級以及腫瘤的血管侵襲相關。進一步驗證發(fā)現(xiàn)SIRT6在肝癌細胞系中表達水平較原代肝細胞PHH及永生化肝細胞MIHA增高。在2個肝癌細胞系中沉默SIRT6可以抑制肝癌細胞的活力及DNA合成能力，也可抑制肝癌細胞集落形成能力及錨定非依賴生長能力。結論: SIRT6促進肝癌細胞的增殖及惡性轉化。

[關鍵詞]Sirtuin 6； 肝細胞癌； 細胞增殖

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)在全球腫瘤死亡率中居第2位[1]。近期對各種癌癥發(fā)病率的統(tǒng)計數(shù)據顯示，原發(fā)性肝癌的全球年齡標準化發(fā)病率為10.1/100 000，其中男性發(fā)病率約為女性的3倍[2]。在原發(fā)性肝癌中，約有80%為肝細胞癌(he-patocellular carcinoma，HCC)。肝細胞癌的全球發(fā)病率在男性中排名第五，女性中排名第七[2]。肝細胞癌起病隱匿，具有發(fā)現(xiàn)晚，放化療及手術切除效果差，預后不良等特點，并最終導致肝細胞癌的死亡率較高[3]。惡性增殖是肝細胞癌最重要病理特征，故研究肝細胞癌惡性增殖的分子調節(jié)機制對于肝細胞癌的干預治療具有重要的意義。

Sirtuin家族是酵母中沉默信息調節(jié)因子2(silent information regulator 2，Sir2)的哺乳動物同源蛋白。Sirtuin家族是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的第Ⅲ類組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)[4]。目前發(fā)現(xiàn)人類的sirtuin家族共有7個成員，它們的細胞定位不同，各自發(fā)揮著重要的生理作用。SIRT1、6、7位于細胞核，SIRT2位于細胞質，SIRT3、4、5位于線粒體[5]。研究證實sirtuin家族成員通過對組蛋白及多種非組蛋白進行去乙?；揎梺碚{節(jié)基因表達[6-7]，參與細胞分化、凋亡、衰老、能量代謝及應激耐受等多種重要的生理活動，從而在多種腫瘤的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[8]。SIRT6定位于細胞核異染色質中，同時具有ADP-核糖基轉移酶和去乙?；富钚?。研究發(fā)現(xiàn)SIRT6可在多種腫瘤中發(fā)揮作用。但對SIRT6在腫瘤形成過程中起促進或抑制作用尚存爭議。且目前關于SIRT6對肝細胞癌增殖及惡性轉化的影響尚不明確。在本研究中，我們從肝癌病人的外周血樣本入手，首先檢測了在200例肝癌病人及50例健康人外周血SIRT6的mRNA表達水平，并將SIRT6的表達水平與多個臨床病理參數(shù)進行統(tǒng)計學分析。進一步檢測SIRT6在正常肝組織、永生化肝細胞及肝癌細胞系中的蛋白表達水平。并在肝癌細胞中沉默SIRT6基因的表達來觀察其對肝癌細胞增殖及惡性轉化的影響。因此，本研究有助于進一步了解肝癌細胞增殖的分子機制，為尋找新的肝細胞癌治療藥物靶點提供了依據。

材料和方法

1材料

200例肝癌病人及50例健康人外周血均來源于重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院。肝癌細胞系SK-Hep-1、PLC/PRF/5、SMMC-7721及永生化肝細胞系MIHA購于ATCC；肝癌細胞系Huh-7購于HSRRB；HM培養(yǎng)基和原代肝細胞系PHH購自ScienCell；人外周血淋巴細胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；GV248-shcont、GV248-shSIRT6-1和GV248-shSIRT6-2質粒購于吉凱基因；SIRT6抗體購于Novus Biologicals；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG及NC膜購于GE；GAPDH及辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG購于Santa Cruz；BCA試劑盒購于Thermo；Cell-LightTMEdU Apollo?488InVitroImaging Kit試劑盒購于銳博公司；CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑(MTS實驗)購于Promega；TRIzol試劑購于Invitrogen；逆轉錄試劑盒購于Bio-Rad；質粒轉染試劑、FastStart Universal SYBR Green Master Mix及EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets (PI) 購于Roche；opti-MEM及DMEM購于Gibco。

2方法

2.1RT-qPCR在試管中加入淋巴細胞分離液，再吸取等體積血液樣本加于分離液之液面上。500×g離心30 min。離心后試管中由上至下分為4層，第1層為血漿層,第2層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層,第3層為透明分離液層,第4層為紅細胞層。用吸管小心吸取第2層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一試管中，生理鹽水洗滌。1 mL TRIzol裂解，提取總RNA。取1 μg逆轉錄為cDNA，隨后進行PCR檢測，以β-actin為內參照。設置復孔3個。以2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達水平。

2.2細胞培養(yǎng)PHH細胞培養(yǎng)于HM培養(yǎng)基中；肝癌細胞系SK-Hep-1、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Huh-7及永生化肝細胞系MIHA均培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清、1% 青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。上述細胞均在含有5% CO2、37 ℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.3質粒轉染接種8×104SK-Hep-1或Huh-7細胞于6孔板中。24 h后更換培養(yǎng)基為無抗生素的DMEM。并將2 μg質粒與6 μL轉染試劑加入200 μL opti-MEM中充分混勻，靜置15 min后逐滴加入6孔板中。轉染24 h后更換培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基。

2.4Western blotting實驗收集細胞，用適量含PI的RIPA裂解液使細胞充分裂解，4 ℃搖床裂解20 min， 16 000×g離心5 min，取上清于新的EP管中。BCA試劑盒測蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，每孔上樣量為30 μg蛋白，將蛋白轉至NC膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，SIRT6 I抗4 ℃搖床孵育過夜，II抗室溫孵育2 h。以GAPDH為內參照。

2.5MTS實驗轉染24 h后將shControl組與shSIRT6組細胞分別消化計數(shù)，并接種8 000個于96孔板中。分別于轉染后2 d、3 d、4 d和5 d向96孔板中加入20 μL MTS試劑，37 ℃孵育2 h，490 nm檢測吸光度(A)值。操作按照Promega試劑說明書進行。

2.6EdU標記實驗在接種之前將蓋玻片加入6孔板中，轉染3 d后進行EdU實驗，操作按照銳博生物試劑盒說明書進行。

2.7平板集落實驗轉染24 h后換液，在培養(yǎng)基中加入0.25 μmol/L嘌呤霉素。每3 d換1次液，當細胞長至50%以上時重新傳代，3周后可觀察到肉眼可見的明顯集落，甲醇固定后0.1%結晶紫染色。

2.8軟瓊脂集落形成實驗將濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠與含有20%血清的2×DMEM充分混勻后加入6孔板中，作為底層膠。轉染24 h后進行細胞計數(shù)，將2 000個細胞加入含有20%血清的2×DMEM中，并與0.7%瓊脂糖凝膠混勻作為上層膠加入6孔板中。每3 d向6孔板中加入幾滴完全培養(yǎng)基。3周后可觀察到肉眼可見的明顯集落，0.05%結晶紫染色。

3統(tǒng)計學處理

結果

1SIRT6在肝癌病人及健康人外周血樣本中的表達差異

將收集的外周血提取RNA后，采用RT-qPCR方法檢測SIRT6的mRNA表達水平。統(tǒng)計學分析結果顯示，在肝癌病人樣本中，SIRT6的mRNA相對表達水平為7.3870±0.7245，癌旁組織中SIRT6的mRNA相對表達水平為1.0090±0.0746。SIRT6的mRNA表達水平在肝癌病人中顯著高于正常人(P<0.01),見圖1。隨后，我們將肝癌病人的SIRT6的mRNA表達水平與多個臨床病理參數(shù)相結合進行統(tǒng)計學分析。結果顯示，SIRT6的表達量增高與腫瘤的大小、腫瘤的分級以及腫瘤的血管侵襲相關(P<0.01)。而與病人的性別、年齡以及腫瘤的分期、壞死、硬化不存在統(tǒng)計學上的相關性，見表1。

Figure 1.The mRNA expression levels of SIRT6 in the periphe-ral blood of HCC patients (n=200) and healthy persons (n=50) detected by RT-qPCR analysis.**P<0.01.

圖1SIRT6在外周血中的mRNA表達水平

表 1SIRT6表達水平與肝細胞癌臨床病理參數(shù)

Table 1.Correlation between SIRT6 expression and clinicopathologic parameters

2SIRT6在不同細胞系中的表達差異

提取原代肝細胞PHH、永生化肝細胞MIHA以及肝癌細胞SK-Hep-1、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Huh-7的總蛋白。Western blotting檢測SIRT6的蛋白表達水平，結果顯示SIRT6在肝癌細胞系中的表達水平明顯高于原代肝細胞和永生化肝細胞，見圖2。

3SIRT6沉默對肝癌細胞增殖的影響

我們首先在SK-Hep-1和Huh-7這2種肝癌細胞系中靶向沉默SIRT6的表達，Western blotting 檢測沉默效率(圖3)。結果顯示，SK-Hep-1和Huh-7細胞中的沉默效率約為90%和80%。并以此為基礎進行MTS實驗，結果顯示SIRT6沉默可顯著抑制肝癌細胞的活力(P<0.01)，且隨著天數(shù)的增加，抑制趨勢更加明顯，在第5 天時抑制率分別達到43%及42%，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)，見圖4。

Figure 2.The protein expression levels of SIRT6 in primary he-patocytes, immortalized hepatocytes and 4 hepatoma cell lines.

圖2SIRT6在細胞系中的蛋白表達水平

Figure 3.The silencing efficiency of shSIRT6 was analyzed by Western blotting analysis.

圖3Western blotting檢測shSIRT6的沉默效率

Figure 4.The effect ofSIRT6 silencing on the viability of HCC cells determined by MTS assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

圖4MTS實驗檢測SIRT6沉默對肝癌細胞活力的影響

在SK-Hep-1細胞中靶向沉默SIRT6的表達，并進行EdU標記實驗。結果顯示SIRT6沉默組肝癌細胞的DNA合成能力明顯減弱，說明沉默SIRT6可顯著抑制肝癌細胞的DNA合成能力，抑制率達43%，見圖5。結合MTS實驗和EdU標記實驗的一致變化，證實沉默SIRT6可顯著抑制肝癌細胞的增殖。

4SIRT6沉默對肝癌細胞克隆形成能力的影響

在SK-Hep-1細胞中靶向沉默SIRT6的表達，以0.25 μmol/L嘌呤霉素處理，3周后0.1%結晶紫染色。結果顯示沉默SIRT6組肝癌細胞形成的集落明顯小于對照組，說明沉默SIRT6可顯著抑制肝癌細胞的克隆形成能力，抑制率達50%,見圖6。

Figure 5.The effect ofSIRT6 silencing on the DNA synthesis of HCC cells detected by EdU incorporation assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

圖5EdU標記實驗檢測SIRT6沉默對肝癌細胞DNA合成能力的影響

Figure 6.The effect ofSIRT6 silencing on the ability of colony formation in HCC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

圖6平板集落實驗檢測SIRT6沉默對肝癌細胞集落形成能力的影響

5SIRT6沉默對肝癌細胞錨定非依賴生長能力的影響

在SK-Hep-1細胞中靶向沉默SIRT6的表達，將2 000個細胞與瓊脂糖凝膠混勻種入6孔板中，3周后0.05%結晶紫染色。結果顯示沉默SIRT6組肝癌細胞形成的集落明顯小于對照組，說明沉默SIRT6可顯著抑制肝癌細胞的錨定非依賴生長能力，抑制率達53%(P<0.01)，見圖7。

Figure 7.Effect ofSIRT6 silencing on the ability of anchorage-dependent growth in HCC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

圖7軟瓊脂集落形成實驗檢測SIRT6沉默對肝癌細胞錨定非依賴生長能力的影響

討論

SIRT6在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用是具有爭議的。有文獻報道SIRT6促進了細胞因子的產生，并促使其遷移到胰腺癌細胞中，并發(fā)現(xiàn)SIRT6促進了炎癥因子和趨化因子的表達，如IL-8和TNF-α，通過增強Ca2+反應，促進了細胞遷移[9]，且在皮膚癌[10]、前列腺癌[11]和乳腺癌[12]中，SIRT6的表達水平是異常增高的。在前列腺癌中，SIRT6基因沉默可以誘導前列腺癌細胞出現(xiàn)G1期細胞周期阻滯和細胞凋亡，并同時增加前列腺癌細胞對化療藥物的敏感性[11]。在乳腺癌病人中，SIRT6的表達上調使得乳腺癌病人對紫杉醇及表阿霉素耐藥，并與病人預后不良相關[12]。這些研究結果揭示著SIRT6作為一種腫瘤促進因子發(fā)揮作用。而另一方面，胚胎成纖維細胞在SIRT6缺失的情況下可以不依賴于致癌基因而發(fā)生腫瘤，提示SIRT6可作為一種腫瘤抑癌因子。且SIRT6的缺失促進了腫瘤細胞的有氧糖酵解，使得腫瘤生長加快[13]。在神經膠質瘤中，SIRT6還可通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活而誘導細胞的凋亡并減少氧化應激，從而抑制腫瘤細胞的生長[14]。此外，SIRT6在人類頭頸部癌和卵巢癌中的表達量異常降低[15-16]。綜上所述，SIRT6在人類復雜的遺傳背景下既可能是抑癌基因也可以是促癌基因。而目前有關SIRT6在肝細胞癌中的報道還很少。

在本研究中，我們從臨床樣本入手，分別檢測了肝癌病人及健康人外周血中SIRT6的表達水平。結果顯示其在肝癌病人外周血中的表達量顯著增高，提示SIRT6可以作為肝癌診斷中新的標志物。且SIRT6的mRNA表達水平增高與腫瘤的大小、分級以及腫瘤的血管侵襲相關。提示其可以作為評價肝癌惡性程度的指標之一。進一步，我們發(fā)現(xiàn)SIRT6在多個肝癌細胞系中也呈現(xiàn)出高表達。沉默SIRT6可抑制細胞的增殖能力和DNA合成能力，并可抑制肝癌細胞的集落形成能力及錨定非依賴生長能力，說明SIRT6基因沉默后可抑制肝癌細胞的增殖及惡性轉化。在SIRT6調控癌細胞增殖的分子機制研究進展中，有文獻報道，在皮膚癌中SIRT6通過抑制AMPK信號通路促進COX-2的表達，從而促進皮膚癌細胞的增殖[10];而在卵巢癌中，SIRT6通過下調Notch3的表達從而抑制了卵巢癌細胞的增殖[16]。說明在不同的腫瘤類型中，SIRT6通過不同的機制發(fā)揮不同的作用。因此，我們也將繼續(xù)研究在肝癌細胞中，SIRT6是通過何種機制發(fā)揮其促進細胞增殖及惡性轉化的作用。綜上所述，我們的結果突顯出sirtuin家族在肝細胞癌增殖及惡性轉化過程中的重要性，為癌癥防治工作提供了有用的工具。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Effect of sirtuin 6 on proliferation of hepatocellular carcinoma cells

TAO Na-na, ZHOU Hong-zhong, REN Ji-hua, CHEN Xiang, LI Wan-yu, LIU Bo, CHEN Juan

(KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDiseases,MinistryofEducation,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:yixin_xinyuan@163.com)

[KEY WORDS]Sirtuin 6; Hepatocellular carcinoma; Cell proliferation

[ABSTRACT]AIM: To illuminate the effect of sirtuin 6 (SIRT6) on the proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC) cells. METHODS: The mRNA expression of SIRT6 in the peripheral blood from 200 cases of HCC patients and 50 cases of healthy people was detected by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). The mRNA expression levels of SIRT6 in the peripheral blood from 200 cases of HCC patients were combined with multiple clinicopathologic parameters for statistical analysis. The protein expression of SIRT6 in primary hepatocytes, immortalized hepatocytes and 4 hepatoma cell lines were determined by Western blotting. The silencing ofSIRT6 was conducted by transfection of vector expressing short hairpin RNA targeting onSIRT6, and the protein level of SIRT6 was measured by Western blotting. The viability of HCC cells was tested by MTS assay. DNA synthesis was analyzed by Cell-LightTMEdU Apollo?488InVitroImaging Kit. The abilities of colony formation and anchorage-dependent growth were measured by colony formation assay and soft agar assay, respectively. RESULTS: The mRNA expression of SIRT6 in the peripheral blood of HCC patients was significantly higher than that in the healthy people, and its expression was highly associated with tumor size, tumor grade and vascular invasion. SIRT6 expression in 4 hepatoma cell lines was significantly higher than that in the others.SIRT6 silencing led to a significant decrease in the cell viability as tested by MTS assay. EdU staining revealed thatSIRT6 silencing reduced DNA synthesis.SIRT6 silencing reduced the ability of colony formation and anchorage-dependent growth as determined by colony formation assay and soft agar assay, respectively. CONCLUSION: Sirtuin 6 promotes the proliferation and malignant transformation of HCC cells.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1031- 06

[收稿日期]2016- 01- 11[修回日期] 2016- 02- 24

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81472271)

通訊作者△Tel: 023-68486780; E-mail: yixin_xinyuan@163.com

[中圖分類號]R735.7; R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.012