史曉偉周學(xué)蘭

1海南師范大學(xué)體育學(xué)院（海南省 海口市 571158）2上海體育學(xué)院運動科學(xué)學(xué)院

TGF-β1多效性與肌腱修復(fù)研究進展

史曉偉1，2周學(xué)蘭1

1海南師范大學(xué)體育學(xué)院（海南省 ?？谑?571158）2上海體育學(xué)院運動科學(xué)學(xué)院

肌腱修復(fù)歷來困擾著腱病患者，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）作為參與肌腱修復(fù)的重要因子，它在修復(fù)過程中的多種生物學(xué)效應(yīng)備受關(guān)注。本文就肌腱修復(fù)過程中TGF-β1的表達，TGF-β1在肌腱修復(fù)中的多效性及其參與肌腱修復(fù)途徑的研究現(xiàn)狀進行綜述，以期為最終了解肌腱修復(fù)機制提供參考和依據(jù)。

TGF-β1；多效性；肌腱；修復(fù)

TGF-β1廣泛存在于人和哺乳動物體內(nèi)，是三種亞型結(jié)構(gòu)（TGF-β1、2、3）中最為活躍的因子。作為轉(zhuǎn)化生長因子家族成員里重要的一員，TGF-β1已被廣泛應(yīng)用到組織損傷的修復(fù)當(dāng)中。長期以來，科研工作者對TGF-β1在肌腱修復(fù)中的作用持不同看法：它既能促進腱細胞增殖，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)；又能產(chǎn)生瘢痕和粘連，引起肌腱纖維化。2012年，美國羅切斯特大學(xué)學(xué)者Farhat在PLoS One雜志上刊登的一篇關(guān)于屈肌腱修復(fù)實驗的論文，其標題中首次使用了“the pleiotropic effects of TGF-β1（中文暫譯：TGF-β1多效性）”，雖然他對屈肌腱修復(fù)中TGF-β1所起的正反兩方面作用進行了初步的探討[1]（促進膠原表達上調(diào)使肌腱再生；破壞細胞外基質(zhì)平衡性導(dǎo)致肌腱纖維化），遺憾的是并未對TGF-β1多效性做出明確的解釋。盡管如此，TGF-β1多效性的提出還是讓人為之興奮。TGF-β1多效性可初步理解為：TGF-β1在肌腱修復(fù)中表現(xiàn)出促進和/或阻礙肌腱修復(fù)的多重生物學(xué)效應(yīng)。這與有機整合TGF-β1在肌腱修復(fù)中不同作用的想法不謀而合：既能言簡意賅表達TGF-β1的多重生物學(xué)效應(yīng)，又為今后進一步研究留有空間。對于肌腱修復(fù)過程中TGF-β1多效性，目前還沒有確鑿的證據(jù)表明TGF-β1究竟是一個“好”因子，還是一個“壞”因子，這也成為了肌腱修復(fù)研究中的熱點和難點。本文綜述肌腱修復(fù)過程中TGF-β1的表達、TGF-β1在肌腱修復(fù)中的多效性及其參與肌腱修復(fù)的途徑，以期為了解肌腱修復(fù)提供參考。

1 肌腱修復(fù)過程中TGF-β1的表達

目前研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在肌腱修復(fù)過程中表達升高，但升高開始的時間點并不一致。Dahlgren[2]給14匹馬前肢的趾淺屈肌腱注射膠原酶以誘導(dǎo)肌腱損傷，并進行了為期24周的觀察，發(fā)現(xiàn)自然修復(fù)開始的第1周TGF-β1即達到高峰。夏長所[3]采用標準Kessler縫合法修復(fù)成年新西蘭兔被切斷的左前中趾屈趾深肌腱，在修復(fù)第1天TGF-β1表達增加，14～21天達高峰，至第56天仍保持在一定水平。Würgler-Hauri[4]將20只SD大鼠雙側(cè)岡上肌腱進行手術(shù)分離，并在第1、2、4、8、16周觀察岡上肌腱自然修復(fù)情況，TGF-β1在第1～2周開始升高，一直保持到第8周，之后便無法測出。Heisterbach[5]切斷大鼠跟腱并進行手術(shù)縫合，發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達在修復(fù)第8周顯著增加。筆者[6]采用電刺激跳躍法對Wistar大鼠進行5周跳躍練習(xí)，成功制造跟腱末端病模型，研究發(fā)現(xiàn)與造模對照組比較，低功率激光修復(fù)可使大鼠跟腱TGF-β1在第1天升高，并在14天內(nèi)表達出較高水平。TGF-β1在時間點上表達的不同可能與實驗動物種類、肌腱損傷類型、修復(fù)方式不一致有關(guān)。

也有個別研究表明肌腱修復(fù)過程中TGF-β1表達并不總是升高。Favata分別取成年羊和幼羊側(cè)伸肌肌腱，切成2 cm長，縫合至專用手術(shù)微型鋼架并移植入成年SCID雌鼠皮下袋中，在第1、3周之后打開植入部位并露出移植的肌腱，研究發(fā)現(xiàn)成年羊肌腱修復(fù)中TGF-β1表達上調(diào)，而幼羊肌腱卻無此變化[7]。這可能與二者肌腱修復(fù)方式不同有關(guān)，TGF-β1在成年羊和幼羊肌腱修復(fù)中表達不同也許只是修復(fù)方式不同的原因之一，同時提示幼羊肌腱有區(qū)別于成年羊肌腱的修復(fù)方式。因此Favata[7]在實驗中推斷幼羊肌腱修復(fù)依靠的

是正常排列膠原纖維的快速再生、最小炎性細胞浸潤和炎性細胞因子表達的無疤痕修復(fù)。這說明了解幼年肌腱修復(fù)方式也許會對成年肌腱修復(fù)提供幫助。

在肌腱修復(fù)過程中，對TGF-β1表達的研究是探討其在肌腱修復(fù)中作用的基礎(chǔ)，雖然目前研究結(jié)果不太一致，但是大部分顯示TGF-β1在肌腱修復(fù)過程中表達升高，這至少表明了TGF-β1在肌腱修復(fù)中起重要作用。

2 TGF-β1在肌腱修復(fù)中的多效性

2.1 TGF-β1在肌腱修復(fù)中多效性的表現(xiàn)

TGF-β1在肌腱修復(fù)中起重要作用，并不是單向有利或有害，而是具有多效性，因而對于TGF-β1在肌腱修復(fù)中作用的分歧較大，爭議不斷。

Bell將6 μl生理鹽水（含100 ng hrTGF-β1和0. 1%超純牛血清白蛋白），注射入小鼠跟腱中部，1天后讓小鼠在傾斜角度17°、速度0.32 m/s的跑臺上持續(xù)跑2周，每天20分鐘，每周5天，成功制造出小鼠跟腱末端病模型，該跟腱最大拉伸應(yīng)力減少約66%，這與跟腱內(nèi)大量軟骨細胞的產(chǎn)生有密切關(guān)系，因此，他認為通過注射TGF-β1可引起小鼠肌腱末端病[8-9]。袁國慶[10]也提到通過注射白細胞介素（interleukin，IL）、TGF-β、生長因子（growth factor，GF）等誘發(fā)炎癥反應(yīng)從而造成肌腱末端病。Stone用自備的細胞因子注射至新西蘭兔的髕腱中部引起肌腱的損傷[11]，但遺憾的是并未說明確切的細胞因子組合。這些研究或是通過TGF-β1注射加上運動制造末端病模型，亦或是與其他細胞因子共同注射以致肌腱損傷，缺乏TGF-β1獨立制造末端病的證據(jù)，因此并不能明確證實TGF-β1是腱病的致病因素。但是從現(xiàn)有的報道中依然可以發(fā)現(xiàn)TGF-β1可能與腱病的產(chǎn)生相關(guān)，但其中的關(guān)系目前還不清楚。

許多文獻報道支持TGF-β1參與肌腱粘連和瘢痕形成。目前研究多是通過抑制TGF-β1表達揭示其對肌腱修復(fù)的不利影響，如殼聚糖、6-磷酸甘露糖、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、TGF-β1中和抗體、miRNA、反義TGF-β1轉(zhuǎn)基因等，這些方法不同程度改善了肌腱修復(fù)環(huán)境，提高了肌腱所在關(guān)節(jié)的活動度，對肌腱粘連和瘢痕形成起到預(yù)防和治療作用[12-19]。減少粘連和瘢痕固然對肌腱修復(fù)有利，但是只通過抑制TGF-β1表達來減少粘連和瘢痕并不一定能夠提高肌腱的力學(xué)性能，從肌腱功能恢復(fù)的角度來看，愈合肌腱的力學(xué)性能可以反映出肌腱修復(fù)的質(zhì)量，這也是肌腱修復(fù)目的之一。Kim[20]利用滲透泵將TGF-β1、2、3中和抗體注射至大鼠肩峰下間隙并沒有改善岡上肌腱—骨的愈合，反而降低了岡上肌腱的力學(xué)性能。Zhou[21]通過含miRNA的RNAi質(zhì)粒沉默TGF-β1表達來預(yù)防屈肌腱粘連，但是肌腱修復(fù)后的最大抗拉伸力量較差。Kim與Zhou的實驗不僅說明了減少肌腱修復(fù)中粘連和瘢痕的重要性，而且指出了肌腱修復(fù)中力學(xué)性能也應(yīng)同樣得到重視。

盡管以上研究認為TGF-β1不僅與腱病的產(chǎn)生相關(guān)，而且還參與肌腱纖維化過程，但是與之截然相反的觀點也大量存在。TGF-β1可促進肌腱愈合[22]、減少肌腱纖維組織機械磨損缺陷[23]、加快肌腱重塑[24]和恢復(fù)肌腱力量[25-26]等。目前許多研究已經(jīng)把TGF-β1作為損傷肌腱修復(fù)有效的重要標志之一：Inoue[27]用刺激頻率50 Hz、強度20 μA和持續(xù)20 min的電針療法修復(fù)大鼠跟腱，發(fā)現(xiàn)7天后TGF-β1大量表達，10天后跟腱最大斷裂力量顯著提高，表明電針療法有利于跟腱修復(fù)。除了應(yīng)用電針療法修復(fù)肌腱外，低功率激光對肌腱修復(fù)也起到了積極作用。低功率激光通過上調(diào)TGF-β1表達或延緩其表達下降，刺激ATP合成并增加細胞內(nèi)鈣離子濃度，促進腱細胞的增殖和膠原的合成，改變炎癥反應(yīng)，加快肌腱修復(fù)速度[6，28-29]。肌腱作為致密結(jié)締組織，損傷之后完全恢復(fù)時間較長，對于下肢爆發(fā)力涉及較多的運動員，其跟腱損傷可能需要成年累月的康復(fù)治療才能恢復(fù)。而上述研究相對于漫長的恢復(fù)時間只能算是肌腱修復(fù)的早期階段，因此，對于TGF-β1促進肌腱修復(fù)的作用究竟最長能夠維持多久，目前尚無定論，這也為接下來的研究提出了新的方向和挑戰(zhàn)。

另外有個別報道顯示TGF-β1對肌腱修復(fù)沒有影響。Fenwick[30]對TGF-β三種亞型及兩種受體在慢性損傷跟腱中作用進行研究，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)中并沒有TGF-β1和TGF-β3表達，因而認為外源性添加TGF-β1在慢性腱病中幾乎無作用。

綜上，TGF-β1在肌腱修復(fù)中多效性表現(xiàn)為：既能參與肌腱粘連和瘢痕的形成又能促進肌腱的愈合。從目前掌握資料來看，TGF-β1既參與肌腱粘連和瘢痕形成，又促進肌腱愈合的不同作用說明它并不是一個單向調(diào)節(jié)肌腱修復(fù)的因子，究竟真正參與肌腱修復(fù)的作用到底是什么還需進一步的研究。

2.2 TGF-β1在肌腱修復(fù)中多效性的原因

目前對TGF-β1在肌腱修復(fù)中的作用還有較大分歧。國內(nèi)持“TGF-β1參與肌腱粘連和瘢痕形成”觀點的學(xué)者多從肌腱的外源性愈合來解釋；而認同“TGF-β1促進肌腱愈合”的學(xué)者又會從肌腱的內(nèi)源性愈合角度來分析。也有人認為肌腱粘連形成的主要原因是肌腱外源性愈合和內(nèi)源性愈合的不平衡結(jié)果所致[31]，并對肌腱的外源性愈合和內(nèi)源性愈合進行了初步的分析。但從現(xiàn)有資料來看，肌腱外源性愈合和內(nèi)源性愈合的觀點尚在探索之中，還未被廣泛認可，其原因有三點：一是國內(nèi)雖有文獻將肌腱愈合分為外源性愈合和內(nèi)源

性愈合，但認為二者是人們在肌腱愈合認識中產(chǎn)生的截然相反觀點[32]，還沒能完善和形成有機的、統(tǒng)一的理論去解釋肌腱修復(fù)；二是國外鮮有將肌腱愈合簡單分為外源性愈合和內(nèi)源性愈合的報道；三是肌腱修復(fù)是一個極其復(fù)雜的過程，目前對其機制了解尚不清楚。

既然TGF-β1在肌腱修復(fù)中多效性表現(xiàn)為：既能參與肌腱粘連和瘢痕的形成又能促進肌腱的愈合，那么究其主要原因可能涉及以下幾點。首先，TGF-β1對肌腱細胞外基質(zhì)平衡性的影響。細胞外基質(zhì)平衡是維持肌腱正常功能的基礎(chǔ)，膠原作為細胞外基質(zhì)中重要的組成，筆者曾研究發(fā)現(xiàn)末端病大鼠跟腱中膠原結(jié)構(gòu)混亂和代謝失衡貫穿于跟腱末端病的整個發(fā)病過程，且膠原的合成和降解處于動態(tài)之中[33]，而TGF-β1可以通過刺激膠原的合成參與肌腱修復(fù)，問題也就此產(chǎn)生：膠原的合成到底有沒有上限，會不會在肌腱中因過分合成而滿足肌腱愈合的同時又打破膠原的平衡而引起粘連和瘢痕？答案尚在探索之中。對于細胞外基質(zhì)中的另外一個重要成分——蛋白多糖（decorin）目前也逐漸被人們關(guān)注，其對膠原修復(fù)的作用主要是抑制膠原纖維化形成[34]，TGF-β1同樣也能抑制蛋白多糖的表達[1，35]，由此可知TGF-β1能通過抑制蛋白多糖參與肌腱修復(fù)，但這并不能簡單理解為蛋白多糖被TGF-β1抑制后，肌腱一定會出現(xiàn)纖維化，因為TGF-β1對細胞外基質(zhì)是整體、復(fù)雜的調(diào)控，它影響細胞外基質(zhì)平衡，但影響如何還不清楚。其次，TGF-β1對肌腱力學(xué)性能的影響。文獻中既有TGF-β1增加肌腱力學(xué)性能的報道[36-37]，又有用抑制或沉默TGF-β1表達的方法減少肌腱纖維化從而導(dǎo)致肌腱力學(xué)性能下降的結(jié)果[20-21]，基于TGF-β1參與肌腱纖維化的前提，卻未能同時提高肌腱的力學(xué)性能，由此說明TGF-β1參與肌腱修復(fù)過于復(fù)雜化。最后，TGF-β1在肌腱中表達持續(xù)時間長短、表達量多寡、表達部位多有不同（肌腱、骨腱結(jié)合部、腱鞘）。由于實驗研究中材料種類、肌腱損傷類型、修復(fù)方式選取不同，TGF-β1在肌腱中表達情況并不一致，其在肌腱中的作用也不同，因此張林等人[38-39]猜測TGF-β1作用可能具有“雙面性”，但未能做進一步的分析。上述的可能原因并不孤立存在，而是復(fù)雜關(guān)聯(lián)，因此對TGF-β1多效性的原因探討僅僅是初步性的，還需更多實驗去證實、分析和總結(jié)。在對TGF-β1多效性的研究基礎(chǔ)上，通過不同方法及手段對TGF-β1在肌腱修復(fù)中多效性進行調(diào)控和整合將會是未來肌腱修復(fù)研究的熱點。如何使TGF-β1“揚長避短”——只表現(xiàn)出對修復(fù)有利的一面而擯棄其不利？這種“理想修復(fù)”究竟存不存在？帶著這些疑問，科研工作者需要對TGF-β1在肌腱修復(fù)中的作用繼續(xù)進行深入探究。

3 TGF-β1參與肌腱修復(fù)的途徑

盡管已有許多證據(jù)表明肌腱粘連和瘢痕的形成是由于TGF-β1，也有實驗證明TGF-β1促進肌腱愈合，這里先暫不討論其對肌腱修復(fù)所起作用是否有利，僅就TGF-β1參與肌腱修復(fù)的途徑，目前還不完全清楚。為了了解肌腱修復(fù)的機制，首先要清楚TGF-β1參與肌腱修復(fù)的途徑，現(xiàn)從已有文獻中歸納并總結(jié)出以下3種途徑。

3.1 直接作用

TGF-β1可能通過破壞細胞外基質(zhì)平衡性直接影響肌腱的修復(fù)。Farhat[1]用不同濃度TGF-β1（1、10、100ng/ml）處理培養(yǎng)中的屈肌腱細胞，基質(zhì)金屬蛋白酶-16（matrix metalloproteinase-16，MMP-16）、蛋白多糖表現(xiàn)出劑量依賴性的表達下調(diào)、雙糖鏈蛋白聚糖（biglycan）、膠原V、膠原XII、纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor，PAI-1）等表現(xiàn)出劑量依賴性的表達升高，TGF-β1直接改變了細胞外基質(zhì)的平衡，導(dǎo)致肌腱粘連和瘢痕形成。也有研究認為TGF-β1通過直接抑制蛋白多糖表達使肌腱基質(zhì)紊亂[35]。其他的一些研究包括：TGF-β1直接產(chǎn)生了抑制MMP-2和纖溶酶（plasmin）生成的PAI-1[40]；TGF-β1加強了與瘢痕組織形成密切相關(guān)成纖維細胞的收縮程度，進而形成瘢痕[41]；TGF-β1直接激活了起粘連作用COMP/ TSP-5基因表達，從而產(chǎn)生肌腱粘連[42]。

除了上述TGF-β1的直接作用使肌腱形成粘連外，有人研究發(fā)現(xiàn)皮膚、韌帶、半月板、軟骨和肌腱修復(fù)過程中均有α肌動蛋白的參與，TGF-β1處理人肩袖腱細胞可顯著增加α肌動蛋白的含量，因此TGF-β1直接產(chǎn)生α肌動蛋白有利于肌腱修復(fù)[43]。另外有報道TGF-β1能直接改善肌腱力學(xué)性能，如髕腱中心部分被切除后，TGF-β1顯著增加了其纖維組織切線模量（tangent modulus）和抗拉力量[36]；TGF-β1顯著提高了應(yīng)力屏蔽髕腱的力學(xué)性能，對應(yīng)力屏蔽髕腱的重塑起重要作用[37]。

3.2 協(xié)同作用

許多文獻提及富血小板血漿已被應(yīng)用于肌腱修復(fù)當(dāng)中[44-46]，它可以長期分泌并大量釋放出多種生長因子，包括TGF-β1、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、胰島素樣生長因子-1（insulin like growth factor-1，IGF-1）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等[47-52]，上述生長因子通過促進成纖維細胞有絲分裂周期的完成，協(xié)同參與肌腱的修復(fù)和愈合[53]。TGF-β1與其他生長因子協(xié)同作用對肌腱修復(fù)的研究現(xiàn)已逐漸增多，使用富含TGF-β1和多種生長因子的富血小板血漿不僅可以長時間促進

肌腱修復(fù)，而且還能從TGF-β1與其他生長因子之間的相互關(guān)系入手對其進行研究，這為今后了解這種協(xié)同作用的機制有很大幫助。

除富血小板血漿外，體外沖擊波也可通過介導(dǎo)TGF-β1、IGF-1與增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的高表達促進腱細胞增殖、膠原合成及組織再生[54-55]。

在修復(fù)早期，經(jīng)羊膜上皮細胞（amniotic epithelial cells，AEC）處理過的肌腱有更好的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，并證實肌腱修復(fù)由TGF-β1和VEGF共同完成[56]。

另有報道證實TGF-β1與生長分化因子-5（growth differentiation factor-5，GDF-5）能共同促進肌腱力量恢復(fù)[57]。IGF-1和TGF-β1聯(lián)合處理可使間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）產(chǎn)生腱細胞[58]。TGF-β1與TGF-β1/VEGF165在肌腱修復(fù)過程中表達增高，TGF-β1消除VEGF165的不利作用，而VEGF165卻不影響TGF-β1促進膠原合成的作用，協(xié)同參與肌腱的修復(fù)[59]。

目前對TGF-β1參與肌腱修復(fù)協(xié)同作用途徑的研究主要集中于TGF-β1與其他細胞因子共同作用于肌腱修復(fù)，而對其他可能的協(xié)同因素如物理刺激（運動、機械載荷）等目前還鮮有報道。在與細胞因子的協(xié)同作用中，TGF-β1究竟如何發(fā)揮作用，發(fā)揮了多大作用，這種作用能夠持續(xù)多久，目前還不清楚。

3.3 信號通路

也有文獻通過對TGF-β1信號通路抑制，減少肌腱粘連和瘢痕促進肌腱修復(fù)的研究。反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）通過對TGF-β1信號通路的調(diào)控減少肌腱粘連，并保持修復(fù)過程中的屈肌腱力量[60]。HGF處理可促進肌腱成纖維細胞AMPK磷酸化和提高乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）活性，通過AMPK信號通路阻滯劑抑制AMPK信號通路，可弱化HGF對TGF-β1引起的肌腱成纖維細胞分化抑制作用，而siRNA介導(dǎo)AMPKα1基因敲除減弱HGF對TGF-β1抑制作用，反之持續(xù)過度表達的AMPKα1可在肌腱成纖維細胞中激活A(yù)MPK信號通路，模擬了HGF的抑制作用，因此，HGF抑制TGF-β1產(chǎn)生的肌腱纖維化是通過肌腱成纖維細胞中AMPK信號通路的作用實現(xiàn)的[61]。由于TGF-β1信號通路較為復(fù)雜，在肌腱修復(fù)中對TGF-β1信號通路的研究目前較少，相信將來會有更多這方面的研究出現(xiàn)。

4 小結(jié)

TGF-β1在肌腱修復(fù)中的多效性說明它不是單向調(diào)節(jié)因子，在肌腱修復(fù)中的作用目前爭議還較大，需要更多的后續(xù)研究去甄別證實，以期調(diào)控其多效性促進肌腱修復(fù)。目前對于TGF-β1參與肌腱修復(fù)途徑的研究還不成熟，后續(xù)的研究可能會豐富肌腱修復(fù)途徑，為最終了解肌腱修復(fù)機制提供參考和依據(jù)。

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2015.04.30

海南省自然科學(xué)基金資助項目（20158361）

周學(xué)蘭，Email：631603000@qq.com