李玲綜述，石蓓審校

?

外泌體基本生物學特性及其治療心肌梗死的研究進展

李玲綜述，石蓓審校

摘要心肌梗死是所有心血管疾病死亡的首要原因。心肌梗死后受損心肌啟動修復及心室重構的分子機制顯示心肌細胞所分泌的可溶性因子在細胞局部交流及遠程信息交換中發(fā)揮重要作用。目前，大量研究證實，以外泌體為主的細胞外囊泡因其運載的細胞特異性蛋白、脂質(zhì)體及遺傳物質(zhì)在細胞及組織交流過程中扮演重要角色。本文將針對外泌體基本生物學特性的研究進行綜述，并評價不同來源的外泌體治療心肌梗死的潛能。

關鍵詞綜述；外泌體；心肌梗死

心血管疾病嚴重危害人類健康，心肌梗死作為缺血性心臟病的典型代表，仍然是全球致死率最高的疾病。在美國，每年有二千萬人死于心血管疾病，其中，有150萬罹患心肌梗死［1］。2001年Anversa課題組首先報道骨髓干細胞可以向心肌細胞分化，隨即掀起干細胞向心肌細胞分化研究的浪潮，經(jīng)過十余年的研究探索，多種干細胞如胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、誘導多能干細胞 （induced pluripotent stem cells，iPSCs）、內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）、心臟祖細胞（cardiac progenitor cells，CPC）及間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等已經(jīng)被證明具有向心肌細胞及內(nèi)皮細胞分化的潛能。然而，在心肌梗死后缺血缺氧的微環(huán)境下，干細胞介導治療心肌梗死所面臨的移植存活率低及歸巢量少［2］等問題促使我們尋找新的替代方法。新近發(fā)現(xiàn)的外泌體（exosomes）是一種存在于細胞培養(yǎng)液中，由細胞分泌到胞外的囊泡狀小體。被認為可作為細胞與細胞間信號傳遞的重要載體，參與心血管疾病病理生理過程［3］，已成為臨床心臟疾病診治研究的熱點。

1 外泌體的來源及基本生物學特性

1.1 外泌體的起源及分泌

“外泌體”一詞首先由Johnstone等［4］在研究網(wǎng)織紅細胞成熟過程中囊泡的形成時提出。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，除網(wǎng)織紅細胞外，外泌體還可由包括干細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、樹突狀細胞、B淋巴細胞產(chǎn)生。除此之外，在多種體液如血液、尿液、精液/前列腺液、羊水和胸腔積液中也可分離提取外泌體［5］。外泌體分泌機制復雜，目前比較公認的機制為：早期的外泌體隨著細胞膜內(nèi)出芽過程的開始而形成，也稱早期核內(nèi)體（early endosomes，EE），接著早期核內(nèi)體二次內(nèi)出芽形成各種管腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），形成晚期核內(nèi)體，包含腔內(nèi)囊泡的晚期核內(nèi)體稱為多泡體（multivesicular bodies，MVBs），在胞外分泌過程中多泡體包含的腔內(nèi)囊泡可以從多泡體的內(nèi)腔釋放到胞外環(huán)境中，所釋放的腔內(nèi)囊泡即為外泌體［6］。有研究顯示外泌體的釋放主要由Rab家族蛋白調(diào)節(jié)，其中Rab27a 和Rab27b控制不同階段外泌體分泌途徑［7］；其次，Rab35和Rab11通過與10A-C結合也能調(diào)節(jié)其分泌［8］。

1.2 外泌體的基本生物學特性

外泌體是在某些特殊生理或者病理狀態(tài)下，細胞選擇性地將一部分蛋白以及遺傳物質(zhì)包裹進入囊泡繼而釋放到細胞外環(huán)境中的微泡結構。目前，主要依據(jù)微泡結構的直徑大小將它們大致分為3類：微粒（microparticle，直徑100 μm～1 nm）、外泌體（直徑30～100 nm）和凋亡小體（apoptotic body，直徑1～4 μm）。外泌體內(nèi)含有大量且種類繁多的蛋白質(zhì)、mRNA及miRNA 等生物活性物質(zhì)。目前已被識別的常見外泌體蛋白包括：轉膜蛋白和融合蛋白（ Rab GTPases、flotillin、膜聯(lián)蛋白）、多泡體生成相關的蛋白（Alix、TSG101）、4次跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81、CD82）、熱休克蛋白（HSP）（HSP70、HSP90）、脂質(zhì)相關蛋白和磷脂酶以及與外泌體來源相關的細胞特異性蛋白［9］。有研究顯示，通過質(zhì)譜分析法檢測骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體穩(wěn)定表達154種蛋白質(zhì)，在這些蛋白質(zhì)中，可能與治療作用相關的包括表面受體（PDGFRB、EGFR、PLAUR） 、信號分子（RRAS/NRAS、MAPK1、GNA13 /GNG12、CDC42 和VAV2） 、黏附分子（FN1、EZR、IQGAP1、CD47、整合素、LGALS1/LGALS3）等［10］。這些蛋白質(zhì)都與其發(fā)揮生物學功能密切相關。

1.3 外泌體的分離及鑒定

目前公認的比較嚴格且廣泛使用的提取方法為蔗糖梯度離心法，首先將收集到的樣品液以100 000～110 000 g的轉速連續(xù)離心制成外泌體球團，重懸外泌體后以同樣方法再次制作外泌體球團［11］。外泌體可在密度為1.13～1.19 g/ml時懸浮，因此，可在超凈環(huán)境下使用蔗糖梯度對其進行分離。目前，新近出現(xiàn)了一些外泌體提取方法，譬如微流體元件、抗體涂成磁珠分選、化學沉淀法及過濾分選法等［12］，其分離效果有待進一步研究證實。

外泌體直徑為30～100 nm，用普通光學顯微鏡無法分辨。電子顯微鏡（electron microscopy analysis，ETM）是初步鑒定外泌體的基本手段。除此之外，動態(tài)光散射分析（dynamic light scattering analysis，DLS）［13］，納米離子跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）［14］均可通過檢測外泌體直徑對其進行鑒定。其中，納米離子跟蹤分析還可檢測外泌體濃度。外泌體進一步鑒定方法有蛋白印記及流式細胞術，質(zhì)譜分析及成像技術等［15］。

1.4 外泌體介導的細胞信號傳導

外泌體一旦釋放，既可直接與周圍環(huán)境中細胞相互作用，也可進入體循環(huán)乃至血腦屏障［16］發(fā)揮細胞間信息傳遞及免疫調(diào)節(jié)等生物學效應。目前，通過外泌體傳遞基因信息已成為表觀遺傳學調(diào)控的一個新領域。很多基于免疫熒光的方法證實，特定器官細胞來源的外泌體能夠選擇性綁定某種靶細胞并被其內(nèi)化，發(fā)揮特定生物學功能。外泌體與受體細胞相互作用的具體機制還不是很清楚，目前比較公認的機制認為外泌體通過特異性受體與受體細胞膜綁定，受體細胞即可通過胞飲方式溶解外泌體囊泡膜使其特異性蛋白、脂質(zhì)及RNA釋放至細胞質(zhì)，也可通過其獨特的內(nèi)吞作用將外泌體內(nèi)化［17］。隨后，外泌體通過轉移蛋白質(zhì)、mRNA及miRNA調(diào)節(jié)局部及整體細胞間的信息交流，進而誘導受體細胞發(fā)生相應的生理改變。外泌體比較重要的功能有通過促血管生成作用加速腫瘤的進展、腫瘤轉移［18］、抗原呈遞及免疫應答、控制纖維化［19］及影響干細胞治療活性等［20］。國外最新研究顯示， 表達EGFRvⅢ的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞能通過分泌外泌體把自身攜帶的EGFRvⅢ轉運給不表達EGFRvⅢ的膠質(zhì)瘤細胞并促進其惡性增殖。此外，Tomasoni等［21］研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞源外泌體（BMSCs-exosomes）通過向受體細胞傳遞特異性mRNA促進細胞增殖。慢性粒細胞性白血病來源的外泌體可刺激MSCs釋放白細胞介素-8 （IL-8），進而加速白血病的進程［22］。因次，外泌體被認為是細胞間傳遞蛋白、mRNA及miRNA的載體。

2 外泌體與心肌梗死

2.1 外泌體在心肌修復中的作用

外泌體早期研究中，目光多聚焦在外泌體與腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制的研究。已有研究證實外泌體源性miRNA通過抑制其靶基因的轉錄，表現(xiàn)出具有誘導細胞遷移、調(diào)節(jié)免疫應答、促進血管發(fā)生從而發(fā)揮影響轉移前微環(huán)境形成及促進轉移等致瘤作用［23］。隨著研究的深入，外泌體在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展及治療中的重要角色逐漸被發(fā)現(xiàn)。Barile等［24］首次通過電鏡在超微結構中發(fā)現(xiàn)了心肌祖細胞中外泌體的存在。Vrijsen等［25］證實來源于心肌祖細胞的外泌體在體外抓傷實驗中能夠促進內(nèi)皮細胞的遷移，提升內(nèi)源性心肌再生能力。Tomasoni等［21］研究證實外泌體在心肌細胞缺血性損傷時發(fā)揮保護作用，可能機制是通過傳遞某些保護性miRNA，促進有利于心肌修復微環(huán)境的產(chǎn)生。這些研究發(fā)現(xiàn)為后續(xù)外泌體對缺血心肌修復機制相關研究奠定基石。

2.2 外泌體源性miRNA與心肌梗死

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一組內(nèi)源性高度保守的小分子非編碼單鏈，約由22個核糖核苷酸組成，通過調(diào)控基因表達和蛋白質(zhì)翻譯過程，進而調(diào)節(jié)細胞和生物體內(nèi)重要的生命活動。研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死和心絞痛患者血漿外泌體中miR-1和miR-133a 的表達水平較正常人顯著升高［26］。另外，有研究證實，循環(huán)中與P53基因相關的多種miRNA（miR-92、miR-194以及miR-34a）在急性心肌梗死后心力衰竭發(fā)生的早期階段明顯上升，且miR-194以及miR-34a主要被包裹于外泌體中而被心肌細胞主動性地分泌至外周循環(huán)中。說明外泌體源性miRNAs在循環(huán)中的水平與心肌梗死后心力衰竭狀態(tài)下左心室舒張末期容積相關性。因此這些外泌體相關的miRNAs可能成為心肌梗死后心力衰竭發(fā)生的早期診斷標志物。有實驗還表明急性心肌梗死后miR-150 在骨髓單核細胞的表達量下降，引起趨化因子受體4（CXCR4）蛋白表達量升高，從而增加了CXCR4 誘導骨髓干細胞遷移歸巢到受損心肌處的作用。這提示心肌梗死后可以通過調(diào)控包含miR-150 的外泌體含量來增加這一遷移作用，從而改善心肌的修復［27］。此外，研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞（embryonic stem cells， ESCs）來源的外泌體可提高心肌梗死后新生血管的形成、促進心肌細胞存活及降低心臟纖維化。進一步體外研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞源外泌體主要通過向受體心臟祖細胞（cardiac progenitor cells， CPCs）傳遞miR-294，促進心臟祖細胞的存活及增殖［28］。Barile等［29］研究發(fā)現(xiàn)心臟祖細胞來源的外泌體內(nèi)miR-210及miR-132高表達，且miR-210通過下調(diào)其目標基因ephrinA3及PTP1b，抑制心肌細胞凋亡；miR-132可抑制目標基因RasGAP-p120表達，增強內(nèi)皮細胞血管生成能力。向心肌梗死心臟注射心臟祖細胞源外泌體可抑制心肌細胞凋亡，促進新生血管形成，提高左心室射血分數(shù)。Tseliou 等［30］研究發(fā)現(xiàn)心球樣細胞來源的外泌體作用于成纖維細胞可改變成纖維細胞表型及成纖維細胞內(nèi)miRNA內(nèi)容，促使其分泌更高水平的基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）及血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF），促進心肌梗死后心功能的恢復。此外，新近研究發(fā)現(xiàn)心肌內(nèi)注射誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）來源的外泌體可通過向心肌細胞傳遞心臟保護性miR-21及miR-210，保護受損心肌免受缺血再灌注損傷［31］。

2.3 預處理外泌體在心肌梗死中的治療效果

目前大量研究采取預處理的方式提高外泌體對心肌梗死的治療效果。Vicencio 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，缺血預處理大鼠血液來源的外泌體可通過高表達的HSP70激活TLR4，進而激活MERK/ERK1/2通路致使HSP27磷酸化，對缺血后的心臟發(fā)揮保護作用。同樣，Yamaguchi等［33］研究發(fā)現(xiàn)，缺血預處理大鼠血液來源的外泌體內(nèi)miR-29a及IGF-1R高表達，降低心肌梗死后氧化應激反應及心臟纖維化，改善心室重構。Gray 等［34］證實，與常氧組比較，缺氧預處理心臟祖細胞來源的外泌體顯著增強內(nèi)皮細胞血管生成能力，降低促纖維化基因轉化生長因子-β（TGF-β）的表達，減少心肌梗死后心臟纖維化，改善心功能。此外，Yu 等［35］通過Microrna矩陣分析證明過表達心肌轉錄因子GATA-4的間充質(zhì)干細胞所提取的外泌體中miR-192和miR-451表達增高，外泌體通過向心臟祖細胞及心肌細胞傳遞高表達的miRNA發(fā)揮抗細胞凋亡、減少乳酸脫氫酶（LDH）釋放的作用，從而改善心肌梗死后心臟功能。Ong 等［36］研究證實過表達缺氧誘導因子-1 （HIF-1）的心臟祖細胞提取的外泌體內(nèi)miR-126及miR-210含量更高，并可通過向受體心臟祖細胞傳遞心臟保護性miR-126及miR-210，激活受體心臟祖細胞促存活激酶，降低代謝需求，提高缺氧環(huán)境下心臟祖細胞耐受能力，改善心肌梗死后心臟祖細胞移植的療效。Kang等［37］通過體外研究發(fā)現(xiàn)過表達CXCR4的間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可顯著上調(diào)心肌細胞內(nèi)胰島素樣生長因子-1α（IGF-1α）及磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（PAKT）水平，下調(diào)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）表達，促進VEGF的表達及血管的生成。同時，體內(nèi)研究證實過表達CXCR4的間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可促進心肌梗死后新生血管的形成，減少心肌梗死面積，改善心室重構，進而促進心肌梗死后心功能恢復。

3 展望

大量研究已證實，外泌體可作為細胞間信息交換，是傳遞信號分子以激活遠隔器官的重要載體。外泌體的這些生物學功能與其攜帶的大分子遺傳物質(zhì)密切相關。其中，miRNA在心肌梗死治療中的療效尤為突出，成為心肌梗死治療領域的研究熱點。近年來，外泌體來源的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）在心血管研究領域中的角色逐漸受到重視。本課題組所承擔的一項國家自然科學基金《心臟干細胞源外泌體LncRNA對急性心肌梗死后心肌修復的調(diào)控機制研究》中，重點研究外泌體來源的LncRAN對缺血缺氧環(huán)境下心臟的保護作用。盡管外泌體在心血管領域的研究還處于起步階段，相信經(jīng)過深入研究及不懈的努力，外泌體對心肌梗死后的心肌修復機制會得到深入了解。外泌體的發(fā)現(xiàn)將會為心肌梗死的患者帶來福音。

參考文獻

［1］ Roger VL， Go AS， Lloyd-Jones DM， et al. American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Executive summary： heart disease and stroke statistics-2012 update： a report from theAmerican Heart Association. Circulation， 2012， 125： 188-197.

［2］ 王艷， 石蓓. 微小核苷酸與干細胞移植治療心肌梗死的研究進展.中國循環(huán)雜志， 2015， 30： 916-918.

［3］ Loyer X， Vion AC， Tedgui A， et al. Microvesicles as cell-cell messengers in cardiovascular diseases. Circ Res， 2014， 114： 345-353.

［4］ Johnstone RM， Adam M， Hammond JR， et al. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles （ exosomes）. J Biol Chem， 1987， 262： 9412-9420．

［5］ 黃楷森， 劉微， 黃德佳. 外泌體在心血管疾病領域的研究現(xiàn)狀. 國際心血管病雜志， 2014， 41： 223-226.

［6］ Babst M. A protein's final ESCRT. Traffic， 2005， 6： 2-9．

［7］ Ostrowski M， Carmo NB， Krumeich S， et al. Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretion pathway. Nat Cell Biol，2010， 123： 235-243.

［8］ Beach A， Zhang HG， Ratajczak MZ， et al. Exosomes： an overview of biogenesis， composition and role in ovarian cancer. J Ovarian Res，2014， 7： 1-11．

［9］ Peinado H， Aleckovic M， Lavotshkin S， et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med， 2012， 18： 883-891.

［10］ Kim HS， Choi DY， Yun SJ， et al. Proteomic analysis of microvesicles derived from human mesenchymal stem cells. J proteome Res， 2011，11： 839-849．

［11］ Théry C， Amigorena S， Raposo G， et al. Isolation and characterization of exosomes from celculture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol， 2006， Chapter 3： Unit 3. 22.

［12］ Momen-Heravi F， Balaj L， Alian S， et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. BiolChem， 2013， 394： 1253-1262.

［13］ Sahoo S， Klychko E， Thorne T， et al. Exosomes from human CD34（+）stem cells mediatetheirproangiogenic paracrine activity. Circ Res，2011， 109： 724-728.

［14］ van der Pol E， Coumans F， Varga Z， et al. Innovation in detectionofmicroparticlesand exosomes. J Thromb Haemost， 2013，11（suppl 1）： 36-45.

［15］ Momen-Heravi F， Balaj L， Alian S， et al. Alternative methods forcharacterizationof extracellular vesicles. Front Physiol， 2012， 3：354.

［16］ Alvarez-Erviti L， Seow Y， Yin H， et al. DeliveryofsiRNA to the mouse brain bysystemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol， 2011，29： 341-345.

［17］ Montecalvo A， Larregina AT， Shufesky WJ， et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells viaexosomes. Blood， 2012， 119： 756-766.

［18］ Kahlert C， Kalluri R. Exosomes in tumor microenvironment influencecancer progression and metastasis. J Mol Med （Berl）， 2013，91： 431-437.

［19］ Borges FT， Melo SA， Ozdemir BC， et al. Tgf-beta1-containing exosomes from injured epithelial cells activate fibroblasts to initiate tissue regenerative responses and fibrosis. J Am Soc Nephrol， 2013，24： 385-392.

［20］ Lee C， Mitsialis SA， Aslam M， et al. Exosomes mediate the cytoprotective action of mesenchymal stromal cells on hypoxiainduced pulmonary hypertension. Circulation， 2012， 126： 2601-2611.

［21］ Tomasoni S， Longaretti L， Rota C， et al. Transfer of Growth Factor Receptor mRNA Via Exosomes Unravels the Regenerative Effect of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev， 2013， 22： 772-780.

［22］ Corrado C， Raimondo S， Saieva L， et al. Exosome-mediated crosstalk between chronic myelogenous leukemia cells and human bone marrow stromal cells triggers an interleukin 8-dependent survival of leukemia cells. Cancer Lett， 2014， 348： 71-76.

［23］ Rana S， Malinowska K， Z?ller M. Exosomal tumor microRNAmodulates premetastatic organ cells. Neoplasia， 2013， 15： 281-295.

［24］ Barile L， Gherghiceanu M， Popescu LM， et al. Ultrastructural evidence of exosome secretion by progenitor cells in adult mouse myocardium and adult human cardiospheres. J Biomed Biotechnol， 2012， 2012：354605.

［25］ Vrijsen KR， Sluijter JP， Schuchardt MW， et al. Cardiomyocyte progenitor cell-derived exosomes stimulate migrationof endothelial cells．J Cell Mol Med， 2010， 14： 1064-1070.

［26］ Kuwabara Y， Ono K， Horie T， et al. Increased microRNA-1 and microRNA-133a levels in serum of patients with cardiovascular disease indicate myocardial damage．Circ Cardiovasc Genet， 2011， 4：446-454．

［27］ Tano N， Kim HW， Ashraf M. Microrna-150 regulates mobilization and migration of bone marrow-derived mononuclear cells by targeting Cxcr4. PLoS One， 2011， 6： e23114.

［28］ Khan M， Nickoloff E， Abramova T， et al. Embryonic stem cell-derived exosomes promote endogenous repair mechanisms and enhance cardiac function following myocardial infarction. Circ Res， 2015， 117： 52-64.

［29］ Barile L， Lionetti V， Cervio E， et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovasc Res， 2014，103： 530-541.

［30］ Tseliou E， Fouad J， Reich H， et al. Fibroblasts Rendered Antifibrotic，Antiapoptotic， and Angiogenic byPriming With Cardiosphere-DerivedExtracellular Membrane Vesicles. J Am Coll Cardiol， 2015， 66：599-611.

［31］ Wang Y， Zhang L， Li Y， et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotectivemiRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in theischemic myocardium. Int J Cardiol，2015， 192： 61-69.

［32］ Vicencio JM， Yellon DM， SivaramanV， et al. Plasma exosomes protect the myocardium from ischemia-reperfusion injury. J Am Coll Cardiol，2015， 65： 1525-1536.

［33］ Yamaguchi T， Izumi Y， Nakamura Y， et al. Repeated remote ischemic conditioning attenuates left ventricular remodeling via exosomemediated intercellular communication on chronic heart failure after myocardial infarction. Int J Cardiol， 2015， 178： 239-246.

［34］ Gray WD， French KM， Ghosh-Choudhary S， et al. Identification of therapeutic covariant microRNA clusters in hypoxia-treated cardiac progenitor cellExosomesusing systems biology. Circ Res， 2015， 116：255-263.

［35］ Yu B， Kim HW， Gong M， et al. Exosomes secreted from GATA-4 overexpressing mesenchymal stem cells serve as a reservoir of antiapoptotic microRNAs for cardioprotection. Int J Cardiol， 2015， 182：349-360.

［36］ Ong SG， Lee WH， Huang M， et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease： role of exosomal microRNA transfer. Circulation， 2014， 130（11 Suppl 1）： S60-69.

［37］ Kang K， Ma R， Cai W， et al. Exosomes Secreted from CXCR4 Overexpressing MesenchymalMesenchymal Stem Cells Promote Cardioprotection via AktSignaling Pathway following Myocardial Infarction. Stem Cells Int， 2015， 10： 155-165.

（編輯：漆利萍）

收稿日期：（ 2015-11-16）

基金項目：國家自然科學基金 （81560041）

作者單位：563003 貴州省遵義市，遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科

作者簡介：李玲 碩士研究生 研究方向為冠心病介入治療 Email：1658543307@qq.com 通訊作者：石蓓 Email： shibei2147@163.com

中圖分類號：R54

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）06-0615-04

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.06.023