楊佳超，　趙云鶴，　蔣　蓉，　陸　利

(山西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，山西 太原 030001)

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18α-GA通過上調(diào)蛋白酶體活性促進(jìn)晚期骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖*

楊佳超，趙云鶴，蔣蓉，陸利△

(山西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，山西 太原 030001)

[摘要]目的： 明確18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinic acid，18α-GA)對晚期骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)衰老標(biāo)志物和增殖能力的影響。方法: 晚期BMSCs(≥14代)應(yīng)用2.0 mg/L的18α-GA持續(xù)作用30 d，比較18α-GA組與DMSO組蛋白酶體活性；衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色和Western blot檢測衰老相關(guān)蛋白p53、p21和p16的表達(dá)變化；CCK-8、BrdU摻入試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分別檢測細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期分布及細(xì)胞周期相關(guān)分子表達(dá)變化。結(jié)果: 應(yīng)用18α-GA 后BMSCs蛋白酶體活性較DMSO組增高約0.2倍(P<0.01)。18α-GA組SA-β-Gal陽性衰老細(xì)胞較DMSO組減少，且細(xì)胞著色淺淡；衰老相關(guān)蛋白p53和p21表達(dá)水平分別較對照組降低(P<0.05)。CCK-8實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示18α-GA組細(xì)胞增殖能力較DMSO組增高，S期細(xì)胞顯著增多(P<0.05)，18α-GA組BrdU染色陽性細(xì)胞率較DMSO對照組增高(P<0.05)。18α-GA組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1及CDK4表達(dá)水平分別較DMSO組增高(P<0.05)。結(jié)論: 18α-GA可激活晚期BMSCs蛋白酶體活性延緩細(xì)胞衰老，并且可能通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平促進(jìn)晚期BMSCs增殖。

[關(guān)鍵詞]18α-甘草次酸； 蛋白酶體； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 細(xì)胞增殖

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是目前組織工程應(yīng)用較廣泛的種子細(xì)胞之一，而源自體內(nèi)的BMSCs數(shù)量有限，需經(jīng)體外長期培養(yǎng)擴(kuò)增后方可用于臨床移植治療。近期的研究報(bào)道表明BMSCs存在復(fù)制性衰老，進(jìn)而限制了其臨床應(yīng)用[1-2]。我們的前期研究結(jié)果證實(shí)蛋白酶體活性降低是BMSCs復(fù)制性衰老的重要因素[3]，增強(qiáng)蛋白酶體活性有助于維持BMSCs細(xì)胞活力，延緩其衰老進(jìn)程[4]。18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinicacid，18α-GA)是一種源自甘草的三萜類抗氧化劑[5-8]。近期研究結(jié)果提示，18α-GA能夠促進(jìn)蛋白酶體亞單位的組裝與合成，提高成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活力[9]。為此，本研究擬觀察18α-GA對晚期BMSCs的影響，探討維持BMSCs細(xì)胞活力的有效途徑，以期為臨床應(yīng)用提供數(shù)量充足的優(yōu)質(zhì)種子細(xì)胞。

材料和方法

1BMSCs的體外培養(yǎng)和18α-GA干預(yù)實(shí)驗(yàn)

BMSCs購自ScienCellResearchLaboratory，用含10%胎牛血清 (HyClone) 的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基(內(nèi)含2mmol/LL-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90% 融合時(shí)進(jìn)行傳代。依據(jù)體外傳代次數(shù)將BMSCs分為早期組(≤4)和晚期組(≥14次)。晚期BMSCs分為18α-GA實(shí)驗(yàn)組(2.0 mg/L的18α-GA持續(xù)作用30 d)和DMSO 溶劑對照組(等體積含DMSO的溶劑持續(xù)作用30 d)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1蛋白酶體活性檢測實(shí)驗(yàn)收集BMSCs，用Lysisbuffer提取蛋白質(zhì)，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，依照蛋白酶體活性分析試劑盒(Millipore)說明書進(jìn)行操作，熒光酶標(biāo)儀激發(fā)光380nm,發(fā)射光460nm處檢測分析。

2.2衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal)染色檢測衰老細(xì)胞將18α-GA干預(yù)完畢的BMSCs消化并調(diào)整至1×107/L，傳代種于包被好的24孔板內(nèi)，加新鮮培養(yǎng)基至1 mL，孵箱培養(yǎng)過夜使其貼壁，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；次日，吸除舊培養(yǎng)基，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗1～2次，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶固定液，室溫固定15 min；吸除固定液，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗3次，于搖床上輕搖；吸除PBS，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色工作液；于濕盒內(nèi)37 ℃避光孵育15～18 h；即刻于顯微鏡下觀察、拍照。

2.3CCK-8實(shí)驗(yàn)和BrdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞活力將細(xì)胞按照每孔2 000個(gè)接種于96孔板，每孔加入10 μL CCK8溶液，培養(yǎng)孵育4 h，酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度。

將MG132和DMSO干預(yù)處理后的細(xì)胞按照1×107/L接種于蓋玻片上，用含有10μmol/LBrdU的培養(yǎng)基作用72h，隨后進(jìn)行BrdU/DAPI免疫熒光雙標(biāo)，熒光顯微鏡(Olympus-BX51)觀察，計(jì)數(shù)。

2.4Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測衰老相關(guān)蛋白及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平收集BMSCs細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度。取20μg總蛋白上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜，5%脫脂奶粉液封閉后加入I抗[p53(1∶1 000)、p21(1∶1 000)、p16(1∶1 000)、兔抗cyclinD1(1∶1 000)、兔抗CDK4(1∶1 000)和兔抗β-actin(1∶2 000)]4 ℃ 孵育過夜，以上抗體購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗兔II抗(1∶5 000)室溫雜交2h，按照化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(GEHealthcareLifeScience)說明書曝光顯影于膠片。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布和細(xì)胞增殖指數(shù)收集BMSCs細(xì)胞，PBS清洗2次，棄上清，輕彈管壁分散細(xì)胞團(tuán)，70% 冷乙醇4 ℃固定4h，1 000r/min室溫離心5min棄上清，PBS重懸細(xì)胞團(tuán)，300 目網(wǎng)過濾，加入50mg/L碘化丙啶(PI)染液(50mg/LPI，10mg/LRNase，1‰TritonX-100)，室溫避光20min后流式細(xì)胞儀檢測G0/G1、S和G2/M各期細(xì)胞分布。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，多組間的比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

118α-GA對晚期BMSCs20S蛋白酶體活性的影響

18α-GA組20S蛋白酶體活性較DMSO對照組顯著上升約0.2倍(P<0.01)，提示應(yīng)用18α-GA可上調(diào)體外擴(kuò)增培養(yǎng)晚期BMSCs20S蛋白酶體活性，見圖1。

Figure1.Theeffectof18α-GAon20Sproteasomeactivityinlate-passageBMSCs.Mean±SEM. n=3.**P<0.01 vsDMSOgroup.

圖118α-GA對晚期BMSCs20S蛋白酶體活性的影響

218α-GA對晚期BMSCs衰老相關(guān)標(biāo)志的影響

18α-GA組SA-β-Gal陽性細(xì)胞數(shù)量較少且著色淺淡，見圖2A。Westernblot結(jié)果表明給予18α-GA后晚期BMSCs衰老相關(guān)蛋白p53和p21表達(dá)水平均較DMSO組下降(P<0.05)，但p16表達(dá)水平無顯著變化，見圖2B。結(jié)果提示應(yīng)用18α-GA有助于延緩BMSCs衰老進(jìn)程。

318α-GA對晚期BMSCs增殖能力的影響

CCK-8檢測結(jié)果表明，晚期BMSCs細(xì)胞增殖能力較早期細(xì)胞顯著下降(P<0.05)；但應(yīng)用18α-GA后，BMSCs細(xì)胞增殖能力較DMSO對照組增高0.3倍(P<0.01)，見圖3A。BrdU染色結(jié)果顯示18α-GA組細(xì)胞BrdU染色陽性率較DMSO對照組增高(P<0.05)，見圖3B。 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也證明，18α-GA組S期細(xì)胞為顯著高于DMSO對照組(P<0.05),見圖3C及表1。

418α-GA對晚期BMSCs細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Westernblot免疫印跡結(jié)果證實(shí)，18α-GA組細(xì)胞周期依賴性蛋白cyclinD1的表達(dá)水平顯著增加，為DMSO對照組的2.8倍(P<0.01)，其激酶CDK4的表達(dá)水平是DMSO對照組的1.4倍(P<0.05)，見圖4。結(jié)果提示應(yīng)用18α-GA能夠增強(qiáng)晚期BMSCs細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1和CDK4的表達(dá)水平。

討論

18α-GA是源于甘草酸的三萜皂苷類化合物，甘草酸是常用中藥甘草中最主要的活性成分之一，在胃腸道微生物中β-葡萄糖醛酸酶作用下水解成甘草次酸后被吸收，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝解毒、增強(qiáng)免疫功能等作用[5-8]。NargesB等[7]研究發(fā)現(xiàn)，18α-GA通過促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟和調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫應(yīng)答，對抗宿主體內(nèi)發(fā)生的傳染病，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。此外，還有研究證明18α-GA能夠促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞凋亡作用，抑制腫瘤細(xì)胞生長[8]。近期研究報(bào)道證明，將18α-GA作用于晚期人成纖維細(xì)胞，可以激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclearfactorE2-relatedfactor2，Nrf2)，促使蛋白酶體亞單位β1、β2和β5轉(zhuǎn)錄激活，增加蛋白酶體的組裝與合成，提高蛋白酶體功能活性，抵抗氧化應(yīng)激，延緩?fù)砥谌顺衫w維細(xì)胞復(fù)制性衰老進(jìn)程[9]。課題組前期研究證實(shí)，蛋白酶體活性下調(diào)是導(dǎo)致晚期BMSCs出現(xiàn)復(fù)制性衰老的重要因素，本研究顯示應(yīng)用18α-GA干預(yù)晚期BMSCs，能夠使BMSCs蛋白酶體活性較DMSO對照組上升約0.2倍，SA-β-Gal染色衰老陽性細(xì)胞數(shù)量減少且著色較淺，提示18α-GA可以增強(qiáng)晚期 BMSCs蛋白酶體功能活性，延緩BMSCs復(fù)制性衰老進(jìn)程。同時(shí)Chondrogianni等[10]和Arslan等[11]應(yīng)用WI38成纖維細(xì)胞作為衰老細(xì)胞模型，觀察蛋白酶體亞單位PSMB5過表達(dá)對細(xì)胞衰老的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)提高蛋白酶體活性可增強(qiáng)細(xì)胞活力，延緩細(xì)胞衰老進(jìn)程，與本課題組的研究結(jié)果相一致。相反，趙云鶴等[12]應(yīng)用蛋白酶體可逆性抑制劑MG132抑制小鼠腦室室管膜下區(qū)蛋白酶體活性后，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力顯著下降，進(jìn)一步表明蛋白酶體活性與細(xì)胞活力密切相關(guān)。

Figure2.Delayedsenescenceprocessoflate-passageBMSCsaftertreatmentwith18α-GA.A：SA-β-Galstaining；B：Westernblotanalysisforp53,p21andp16expression.Mean±SEM. n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

圖218α-GA對晚期BMSCs衰老相關(guān)標(biāo)志的影響

Figure3.Theeffectof18α-GAoncellproliferationinBMSCs.A：CCK-8assay;B:BrdUincorporationassay;C:flowcytometry.Mean±SEM. n=6.#P<0.05vsearly group；*P<0.05,**P<0.01 vsDMSOgroup.

圖318α-GA對BMSCs增殖能力的影響

表1流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSCs細(xì)胞周期分布

Table1.ThecellcycledistributionofBMSCsmeasuredbyflowcytometry(%.Mean±SEM. n=6)

GroupG0/G1phaseSphaseG2/MphaseEarly83.91±3.7514.64±1.942.94±0.32DMSO93.12±0.79**3.54±1.01**3.67±0.0718α-GA90.97±0.04**7.01±0.65**#2.03±1.01

**P<0.01vsearly group；#P<0.05vsDMSO group.

Figure 4.The expression of cyclin D1 and CDK4 in late-passage BMSCs after treatment with 18α-GA. Mean±SEM.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

圖418α-GA對晚期BMSCs 的cyclin D1和CDK4表達(dá)水平的影響

已有研究報(bào)道隨傳代次數(shù)增加，晚期細(xì)胞p53、p21、p16等衰老相關(guān)蛋白表達(dá)水平上升，細(xì)胞自我更新和增殖能力喪失[1, 13-15]。Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在纖維軟骨髓核細(xì)胞的衰老過程中，p53表達(dá)上調(diào)，而p53活性增高可促進(jìn)p21的表達(dá)從而激活pRB，進(jìn)而引起細(xì)胞衰老。Christian等[16]應(yīng)用人類晚期B-J包皮成纖維細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染GSE-22使p53失去活性后，細(xì)胞中DNA的合成以及細(xì)胞增殖上調(diào)90%左右，細(xì)胞群體倍增次數(shù)增高，證明p53失活可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞復(fù)制性衰老。課題組研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用18α-GA 干預(yù)晚期BMSCs提高蛋白酶體活性后，衰老相關(guān)蛋白p53和p21表達(dá)水平下降，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1和CDK4的表達(dá)增高，CCK8、BrdU染色和流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果也顯示細(xì)胞增殖能力提高，S期細(xì)胞明顯增多，提示18α-GA可通過抑制晚期BMSCs 細(xì)胞p53和p21表達(dá)活性，激活細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1和CDK4的表達(dá)，促進(jìn)晚期BMSCs越過G1/S細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換點(diǎn)，恢復(fù)晚期BMSCs細(xì)胞增殖能力，改善細(xì)胞生長速度，延緩細(xì)胞衰老進(jìn)程。

由此可見，18α-GA作用于晚期BMSCs，可以上調(diào)蛋白酶體活性進(jìn)而延緩BMSCs的復(fù)制性衰老進(jìn)程，恢復(fù)細(xì)胞活力。本研究采用化合物改善BMSCs蛋白酶體活性，此方法較基因修飾等手段更安全，并且操作簡便，易于推廣，為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

*[基金項(xiàng)目]廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項(xiàng)課題(No. B2012195)；國家中醫(yī)藥管理局三級實(shí)驗(yàn)室病理生理實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(No. 2011ZD004)

Upregulationofproteasomeactivityby18α-GApromotesproliferationoflate-passageBMSCsin vitroYANGJia-chao,ZHAOYun-he,JIANGRong,LULi

(Department of Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China. E-mail: luli7300@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of 18 alpha-glycyrrhetinic acid (18α-GA) on delaying the senescent progress and promoting the proliferation in late-passage bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). METHODS: Late-passage BMSCs were incubated with 2.0 mg /L 18α-GA or the same volume of DMSO for 30 d, and the cells were harvested to determine the proteasome activity. The expression of senescence-related proteins p53, p21 and p16 was detected by senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining and Western blot. The cell proliferation, the expression level of cell cycle-related proteins and cell cycle distribution of the cells were measured by CCK-8 assay, BrdU incorporation, Western blot and flow cytometry. RESULTS: Compared with DMSO group, the proteasome activity in 18α-GA group increased significantly by about 0.2 times (P<0.01). SA-β-Gal-positive cells in 18α-GA group decreased, and cell staining was lighter. The contents of p53 and p21 in 18α-GA group were decreased (P<0.05). The results of CCK-8 assay showed that the A value in 18α-GA group was 0.3 times higher than that in DMSO group (P<0.01). BrdU incorporation showed the increased proliferation in 18α-GA group compared with DMSO group (P<0.05). The cells in G1phase in 18α-GA group decreased significantly compared with DMSO group, while the cells in S phase increased significantly (P<0.05). The expression level of cyclin D1 in 18α-GA group was 2.8 times higher than that in DMSO group (P<0.01), and the CDK4 level was 1.4 times higher than that in DMSO group (P<0.05). CONCLUSION: Activation of the proteasome activity by 18α-GA delays the aging process in the BMSCs and promotes the cell proliferation via up-regulation of the cell cycle-related proteins.

[KEY WORDS]18α-Glycyrrhetinic acid; Proteasome; Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell proliferation

通訊作者△Tel: 020-38688909; E-mail: tzhuker@jnu.edu.cn

[收稿日期]2015- 09- 06[修回日期] 2015- 10- 30

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2188- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.012

[中圖分類號]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A