田 楓 張 闊 鄭振輝
(北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部,北京100191)
免疫缺陷大、小鼠在腫瘤學研究中的應用及實驗中常見問題分析
田楓張闊鄭振輝
(北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部,北京100191)
[摘要]目的:免疫缺陷大、小鼠在腫瘤學研究中發(fā)揮著越來越重要的地位,但由于其品系較多,實驗者往往無從選擇,本文對常用的免疫缺陷大、小鼠的特點及其應用進行分析探討。方法:從免疫缺陷動物的分類、先天性免疫缺陷大、小鼠的特點及應用比較和腫瘤學研究中常見問題分析三個層次加以論述。結果:腫瘤學研究中應切實綜合考慮各個免疫缺陷大、小鼠的特點。結論:為科研工作者使用免疫缺陷大、小鼠進行腫瘤學研究提供了有價值的參考資料。
[關鍵詞]免疫缺陷;小鼠;大鼠;腫瘤學
免疫缺陷動物是指由于先天遺傳突變或用人工方法造成一種或多種免疫系統(tǒng)組成成分缺陷的動物[1]。最具代表性的動物是1962年發(fā)現的裸小鼠,近年來隨著實驗動物學和分子生物學的迅猛發(fā)展,一些新的免疫缺陷大、小鼠培育成功,在腫瘤學研究中發(fā)揮著越來越重要的地位,然而這些品系繁多的免疫缺陷動物,他們有著怎樣的背景,在腫瘤學實驗中如何進行選擇是令許多科研工作者迷惑的問題。本文就常用的免疫缺陷大、小鼠的特點及其應用進行比較說明,并就其在飼養(yǎng)管理中和腫瘤學研究中的一些常見問題進行分析。
1免疫缺陷動物的分類
免疫缺陷動物主要分為先天性免疫缺陷和獲得性免疫缺陷動物。本文主要闡述先天性免疫缺陷動物,包括T淋巴細胞功能缺陷、B淋巴細胞功能缺陷、NK細胞功能缺陷、聯合免疫缺陷四大類。而獲得性的免疫缺陷動物指AIDS動物模型,這里不做介紹。
2先天性免疫缺陷大、小鼠的特點及應用比較
2.1T淋巴細胞功能缺陷小鼠T淋巴細胞功能缺陷動物是最常用的免疫缺陷動物,這類動物的特點一般為胸腺殘留一些上皮樣細胞;淋巴組織胸腺依賴區(qū)的淋巴細胞消失;外周血淋巴細胞減少。雖然有原始的T細胞,但缺乏成熟的T細胞。B細胞數量功能正常或功能有缺陷,合成的免疫球蛋白主要是IgM,只有少量IgG。粒細胞功能較低,NK(Natural killer cells)細胞活性正常或高。
2.1.1裸小鼠國內通常使用的T淋巴細胞功能缺陷小鼠主要有三個品系,分別是BALB/c Nude小鼠、NU/NU小鼠和CD-1 Nude小鼠,關于三個品系小鼠的異同點我們從5個方面加以比較[2]。
背景不同:BALB/c Nude小鼠來源于BALB/c小鼠基因突變;NU/NU小鼠最初由美國國立衛(wèi)生研究院培育成功,是一個獨立的封閉群品系;CD-1 Nude小鼠是將nu基因導入CD-1小鼠獲得的品系。
遺傳學控制不同:BALB/c Nude小鼠為近交系,采用兄妹交配方式進行繁殖,后代基因純合程度高,個體間差異小;NU/NU、CD-1 Nude為封閉群,采用隨機交配方式進行繁殖,后代基因純合程度低,個體間差異大。
生理學性狀的相同點:繁育方式均采用雄性純合子(nu/nu)與雌性雜合子(nu/+)交配,后代個體均有無毛純合體“nu/nu”和有毛雜合體“nu/+”之分,比例接近1∶1。
免疫缺陷程度:三個品系小鼠免疫缺陷相同,都沒有胸腺,不產生T淋巴細胞;但是B淋巴細胞和NK細胞功能正常。
應用范圍:BALB/c Nude、NU/NU、CD-1 Nude小鼠均可用于腫瘤學研究和腫瘤移植;通常實驗中使用BALB/c Nude小鼠建立異種移植瘤模型較常見。相對于BALB/c Nude而言,NU/NU、CD-1 Nude腫瘤細胞接種量相對較大,一般腫瘤細胞數量需大于107以上,而且成瘤的速度會比BALB/c Nude慢1~2周。
2.1.2裸大鼠國內實驗動物供應商提供的裸大鼠是含有裸基因的8個近交系大鼠(BN、MR、BUF、WN、ACI、WKY、M520、F344)在一系列交配之后育成的NIH裸大鼠。該裸大鼠雖然也無毛,但其外觀是白色,黑色,黑白相間的。部分個體在發(fā)育的不同階段,會交替出現有毛和無毛的現象。
裸大鼠沒有胸腺,缺乏T細胞,在胸腺外周淋巴器官的主要區(qū)域表現為細胞群體衰竭特征。與裸小鼠相比,裸大鼠可為常規(guī)血液學和血清生物化學分析實驗提供足夠的血樣,同時大鼠易于進行外科手術,為腫瘤移植和腫瘤供血研究提供了方便。但其價格約為小鼠的3~4倍。
2.2B淋巴細胞缺陷小鼠CBA/N小鼠為X-連鎖免疫缺陷小鼠,是B淋巴細胞功能缺陷疾病模型,臨床常表現為免疫球蛋白缺失,但細胞免疫正常。該小鼠較少應用于腫瘤學研究中。
2.3NK細胞缺陷小鼠Beige小鼠屬于NK細胞功能缺陷疾病模型,beige基因為13號常染色體隱性突變基因,該小鼠表現為明顯的黑色素體減少。Beige小鼠免疫抗腫瘤殺傷作用出現較晚,缺乏細胞毒性T細胞功能,對同種、異種腫瘤細胞的體液免疫功能減弱,欠缺巨噬細胞的抗腫瘤活性、殺傷細胞活性等。此小鼠亦較少單獨在腫瘤學研究中應用。
2.4聯合免疫缺陷小鼠
2.4.1嚴重聯合免疫缺陷小鼠SCID(Severe combined immunodeficiency)小鼠即嚴重聯合免疫缺陷小鼠,是先天性T和B淋巴細胞免疫缺陷動物,是1983年在C.B-17突變小鼠中發(fā)現的。SCID小鼠由位于第16對染色體被稱為scid的單個隱性突變基因所導致,表現為T、B淋巴細胞免疫功能缺陷,細胞免疫和體液免疫功能缺陷,但巨噬細胞和NK細胞功能未受影響[3]。SCID小鼠外觀與BALB/c小鼠無差異,體表有毛呈白色,體重發(fā)育亦基本正常。
一定比例的SCID小鼠在青年時期可出現一定程度的免疫功能恢復,即存在滲漏現象。滲漏現象并不遺傳,但與小鼠的年齡、品系、飼養(yǎng)環(huán)境有關。某種程度上滲漏現象的存在影響了SCID小鼠在腫瘤學研究中的應用。
2.4.2C3H SCID小鼠C3H SCID小鼠是將scid突變基因引入C3H小鼠中而育成C3H SCID重組近交系。C3H SCID小鼠與SCID小鼠相比,除背景基因不同外,發(fā)現在三月齡時C3H SCID小鼠僅有約15%可測到血清免疫球蛋白,而SCID小鼠免疫球蛋白有時可高達70%以上。C3H SCID小鼠并不因年齡的增長而增加血清免疫球蛋白陽性的比例,也不會隨年齡的增長增加血清中免疫球蛋白濃度。因此C3H SCID在腫瘤學研究中較SCID小鼠有一定的優(yōu)勢。
2.4.3SCID.BG小鼠SCID.BG小鼠是利用BALB/c- beige/beige同源近交系小鼠將beige基因引入CB-17 SCID小鼠。beige基因突變小鼠降低體內NK細胞活性,優(yōu)化了單獨使用SCID小鼠NK細胞活性較高的問題[4]。
2.4.4NOD/Lt-SCID小鼠NOD/Lt-SCID小鼠是將scid突變基因導入到非肥胖糖尿病NOD(non-obese diabetes)小鼠身上獲得的動物,scid突變基因的純合影響了T、B淋巴細胞的正常發(fā)育。同時NOD/Lt-SCID小鼠NK細胞和結合補體的能力較為低下。
2.4.5SHO小鼠SCID小鼠盡管為嚴重聯合免疫缺陷小鼠,但其有毛的特點,對于腫瘤的生長觀察并不有利。美國的研究人員通過將SCID小鼠和無毛研究人員將人前列腺癌細胞株(PC-3)分別接小鼠這兩個品系雜交,在2008年培育成功了在兩條染色體上均帶有SCID基因的無毛封閉群小鼠模型SHO(SCID hairless outbred)。種到SCID和SHO身上,發(fā)現SHO除去具有與SCID小鼠相同的腫瘤生長特性之外,還優(yōu)化了NU/NU接種PC-3時出現的皮膚潰瘍現象??梢奡HO小鼠用于腫瘤學研究較裸鼠有一定的優(yōu)越性。
2.4.6NPG、NSG、NCG或NOG小鼠NPG、NSG、NCG或NOG小鼠均指NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠,是目前國際公認的免疫缺陷程度最高的小鼠。NOD為自發(fā)性Ⅰ型糖尿病小鼠,其巨噬細胞對人源細胞吞噬作用弱;補體系統(tǒng)和樹突狀細胞等先天免疫系統(tǒng)功能較低。Prkdcscid的含義是Prkdc(Protein kinase DNA-activated catalytic)基因突變,小鼠的T和B細胞缺失,表現為細胞免疫和體液免疫的重度聯合免疫缺陷(SCID)。IL-2rgnull的含義是Interleukin-2受體的gamma鏈(IL-2R γc,又稱CD132)是具有重要免疫功能的細胞因子IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的共同受體亞基,該基因敲除后的小鼠機體免疫功能嚴重降低,尤其是NK細胞的活性幾乎喪失[5,6]。
NPG等小鼠與NOD/Lt-SCID小鼠相比壽命更長,平均達1.5年,對人源細胞和組織幾乎沒有排斥反應,少量細胞即可成瘤,而且無B淋巴細胞泄漏現象。 綜上所述,將幾種主要用于腫瘤學研究的免疫缺陷品系特點歸納如表1。
表1常用于腫瘤學研究的免疫缺陷大、小鼠特點及應用比較
Tab.1Characteristic and application of immunodeficiency rats and mice in oncology research
Note:-.Deficiency;+.Normal.
3腫瘤學實驗中常見問題分析
3.1免疫缺陷大、小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境免疫缺陷大、小鼠由于其免疫功能受損,易受到病原微生物的侵擾,特別是易受到鼠肝炎病毒的攻擊,導致動物感染鼠肝炎,表現為體重減輕,患消耗綜合征,肝臟亦受到損傷,嚴重威脅腫瘤實驗的正常進行。因此理論上免疫缺陷小鼠應飼養(yǎng)于隔離環(huán)境中,但隔離的環(huán)境對于動物實驗操作極其不便,若是進行腫瘤學動物實驗,免疫缺陷大、小鼠亦可飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中,現在比較慣常的飼養(yǎng)方式是將其飼養(yǎng)于獨立送風籠盒中(IVC,Isolated ventilated cages)籠具中,搭配超凈工作臺進行腫瘤學實驗是比較切實可行的。
免疫缺陷大、小鼠按微生物控制程度分類,應該屬于無特定病原體級動物,該級別動物可飼養(yǎng)于屏障環(huán)境和隔離環(huán)境中。
3.2關于裸鼠長毛的問題首先需要明確的是裸鼠并不是真正意義上的無毛,長毛是一種正常的生理現象。根據裸鼠的繁育方式為無毛的純合子雄性(nu/nu)和有毛的雜合子雌性(nu/+)進行交配。這種繁育方式下,所產生的后代會有二種情況,一種情況是接近60%的個體表現為被毛正常的雜合子(nu/+);另一種情況是40%的個體為體表無毛的純合子(nu/nu),也就是一般概念上的裸鼠。
對上述兩種情況的后代,裸鼠毛囊與同窩出生的正常有毛仔鼠相比,從組織學切片來看,毛囊數量和功能都沒有差別,均能夠產生正常的毛根和毛桿。但是對于純合子裸鼠(nu/nu)來說,由于Foxn1基因功能缺失,毛桿中缺乏由Foxn1控制表達的角蛋白,變得非常纖弱,絕大部分毛桿不能正常穿透表皮,而是扭曲盤繞在膨脹的毛囊漏斗內。因此從外觀上看皮膚是裸露的,并由此誤解認為裸鼠就是體表無毛的。
但是實際上,裸鼠出生后大約十天左右,在頭面部、頸部可見稀疏的毛發(fā)生長;隨著周齡增加,在軀干的其他部位也可見稀疏毛發(fā)的生長。這些穿透了表皮的毛桿也是嚴重扭曲的,而且經常在長到應有長度前就折斷了[7]。
3.3從國內外若干腫瘤接種實驗和藥物研發(fā)單位使用情況來看,這部分長有稀疏被毛的裸鼠對實驗結果沒有影響。
關于牛棒狀桿菌感染除了裸鼠正常的長毛外,裸鼠可能由于試驗系統(tǒng)染菌而長毛或感染,造成此狀況的影響因素較多,最典型的因素為牛棒狀桿菌感染。牛棒狀桿菌是一種常見的大棒狀桿菌,免疫功能正常的大、小鼠一般不長期攜帶,但對免疫缺陷大、小鼠致病,一旦感染,幾乎是終身性。裸鼠的主要表現為身體長白色鱗屑,該癥狀會在14~20 d后消失,但是病毒的感染和排毒至少要持續(xù)30d以上,此時動物表現為體重減輕,攝水量增加,異種移植腫瘤生長緩慢,對化療的敏感性增加等[8]。
裸鼠一旦感染牛棒狀桿菌,對腫瘤學研究的危害非常大,但是目前根據我國的實驗動物國家標準,該菌并不在SPF級小鼠應排除的病原菌之內。
3.4皮下包埋雌激素藥片后小鼠死亡目前乳腺癌的研究在腫瘤學實驗中占有比較大的比重。在給動物接種乳腺癌細胞時由于大、小鼠體內自身分泌的雌激素不能夠滿足某些雌激素受體陽性的乳腺癌細胞的生長,實驗中常常選擇17-β雌二醇緩釋藥片來支持腫瘤細胞生長。但該緩釋藥片放置皮下一段時間后個別動物會出現嚴重的泌尿生殖系統(tǒng)感染,導致排尿困難,最終造成動物死亡。因此,在包埋雌激素藥片后若發(fā)現個別大、小鼠出現膀胱腫脹、排尿困難后,需要每天人為幫助其進行排尿,保持墊料清潔并用含有無菌生理鹽水的棉簽擦拭會陰部以減少死亡情況的發(fā)生。此外,根據不同腫瘤細胞系及動物品種、品系選擇合適規(guī)格的17-β雌二醇緩釋藥片也至關重要。
3.5性別選擇大、鼠性別的選擇對腫瘤細胞異種移植成功率也有至關重要的影響。若腫瘤細胞的獲得是從女性患者身上分離得到的,試驗中盡可能選擇雌性動物;反之盡可能選擇雄性動物。
3.6實驗終結時間受實驗動物福利政策保護,當個別實驗組小鼠皮下移植瘤平均腫瘤體積達到2 000 mm3(大鼠8 000 mm3),或單個小鼠腫瘤體積達到3 000 mm3(大鼠12 000 mm3)時應將該組(或該只)動物實施安樂死。在給藥過程,當動物體重下降超過初始體重的20%時應停止給藥,直到體重恢復至初始體重的80%以上時再繼續(xù)給藥。
4結語
總之免疫缺陷大、小鼠種類較多,各不同品系具有不同特點,影響腫瘤學研究的因素也很多,研究人員必須根據實際需要,熟悉各個品系動物的特征,結合自身科研情況和經濟情況,選擇恰當的品系和性別,并在實驗中注意飼養(yǎng)條件等因素對動物實驗的影響,這樣才能確保腫瘤學實驗的順利進行,以獲得預期的實驗結果。
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[收稿2015-07-10修回2015-08-11]
(編輯許四平)
Application of immunodeficiency rats and mice and analysis of common problems in oncology research
TIANFeng,ZHANGKuo,ZHENGZhen-Hui.DepartmentofLaboratoryAnimalScience,PekingUniversityHealthCenter,Beijing100191,China
[Abstract]Objective:The immunodeficiency animals play more and more important role in oncology research.But researchers usually do not how to choose kinds of immunodeficiency rats and mice during experiments.In this paper, applications and characteristics of immunodeficiency animals were compared as well as some of the common problems were discussed in oncology study.Methods: Classification of the immunodeficiency animals, the characteristics and application of congenital immunodeficiency rats and mice, and common problem analysis in the study of oncology were explored.Results: The feature of various immunodeficiency rats and mice should be considered in the oncology experiments.Conclusion: The paper provide valuable reference for scientific researcher.
[Key words]Immunodeficiency;Mice;Rats;Oncology
通訊作者及指導教師:張闊(1979年-),男,碩士,主管技師,主要從事實驗動物管理與研究,E-mail:zhangkuo@bjmu.edu.cn。
作者簡介:田楓(1973年-), 女,博士,副主任技師,主要從事實驗動物研究與管理方面研究,E-mail:fengtian_38@163. com。
中圖分類號R73-35 Q95-331
①本文受北京高等學校青年英才計劃項目(YETP0057)資助。
文獻標志碼A
文章編號1000-484X(2016)02-0214-04
doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.015 10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.016