陳飛燕，陶偉偉,,，陳扣玉，張嘉卿，王雨青，陳　剛，段金廒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究中心；2.中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京　210023)

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京大戟中二萜類化合物pekinenal對肝癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響

陳飛燕1，陶偉偉1,2,3，陳扣玉2，張嘉卿2，王雨青2，陳剛2，段金廒3

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究中心；2.中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京210023)

摘要:目的研究京大戟中二萜類化合物pekinenal對肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響，并初步探討其治療肝癌可能的影響機(jī)制。方法采用MTT法分析不同濃度的pekinenal對體外培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響；采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)、Annexin V/PI 雙染法和電鏡觀察對細(xì)胞凋亡的作用；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析對細(xì)胞周期的影響。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，pekinenal可明顯抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖，呈濃度依賴性。Annexin V/PI 雙染法結(jié)果顯示，隨著pekinenal濃度的增加，肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡率明顯增加，與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。TUNEL法檢測結(jié)果表明，不同濃度的pekinenal作用于SMMC-7721細(xì)胞后均可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，凋亡指數(shù)(AI)隨著藥物濃度的升高明顯增加(P<0.01)。給藥后電鏡觀察，與對照組比較，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞質(zhì)包涵體形成，部分細(xì)胞核呈現(xiàn)凋亡表現(xiàn)，并且隨著藥物濃度增加，凋亡現(xiàn)象越明顯。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，不同濃度的pekinenal均可使細(xì)胞被阻滯于S期。結(jié)論pekinenal對人肝癌細(xì)胞增殖有明顯地抑制作用，并存在著明顯的濃度依賴關(guān)系；pekinenal可能是通過抑制癌細(xì)胞DNA的合成，將人肝癌細(xì)胞周期阻滯在S期，抑制其增殖，通過誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡等，發(fā)揮其抗肝癌作用。

關(guān)鍵詞：京大戟；pekinenal；SMMC-7721；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

原發(fā)性肝癌發(fā)病率高，早期不易發(fā)現(xiàn)，確診時約90%已屬中晚期，而大多數(shù)化療藥物因副作用較大，患者難以接受大劑量治療[1]。京大戟為大戟科Euphorbiaceace大戟屬Euphorbiagenus植物大戟EuphorbiapekinensisRupr.的干燥根[2]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，為中醫(yī)臨床常用的峻下逐水藥，性寒，味苦、有毒[3]。歸肺、脾、腎經(jīng)。臨床上常用于胸膜炎積水、晚期血吸蟲病腹水、肝硬化腹水及精神分裂癥等[4]。pekinenal是課題組前期從京大戟中分離提取出來具有抗癌作用的二萜類化合物[5]，目前對其抗腫瘤作用機(jī)制尚未見報道。本研究針對化合物pekinenal對肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、周期及凋亡作用的影響，探討其對肝癌可能的作用機(jī)制。

1材料

1.1細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株SMMC-7221購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

1.2主要藥品與試劑化合物pekinenal：由本實(shí)驗(yàn)室從京大戟中分離得到。京大戟藥材購于安徽省亳州市藥材總公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為大戟科大戟屬植物大戟EuphorbiapekinensisRupr.的干燥根；MTT(solarbio，批號321E054)；原位細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL)試劑盒(Roche，批號11684795910)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號1221119)；DMSO(Sigma 公司，批號 302A0324)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，批號8114281)；Alexa Fluor 488 Annexin V and PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Invitrogen，批號V1324)。

2方法

2.1MTT法觀察pekinenal對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響取對數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞，消化制成單細(xì)胞懸液后，以3×107·L-1濃度接種于96孔板內(nèi)，100 μL/孔，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為0.05的飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。小心吸棄上清，以每孔100 μL依次加入所配備好不同濃度的藥物pekinenal，空白對照組加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)5個復(fù)孔。置37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為0.05的飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT( 5 g·L-1) 20 μL，繼續(xù)孵育培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，將板子置于搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀492 nm波長處檢測各孔吸光度，按公式計算pekinenal對SMMC-7721細(xì)胞的生長抑制率，抑制率(IR)：IR%=(1-A藥物組均值/A空白對照組均值)×100%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的pekinenal濃度，繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2Annexin V/PI染色檢測pekinenal對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響以 6.25、12.5、50 μmol·L-1pekinenal處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞48 h，分別消化收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×109·L-1，4 ℃ PBS洗滌2次，棄上清液。加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液100 μL重懸細(xì)胞，置冰浴。加入10 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI于細(xì)胞懸液中，輕輕混勻；將試管置于室溫避光染色15 min。補(bǔ)加 400 μL結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞的百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3原位末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察各組SMMC-7721細(xì)胞凋亡情況將制備好的細(xì)胞標(biāo)本根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇的濃度加藥，實(shí)驗(yàn)組分別加入等量濃度為 6.25、12.5、50 μmol·L-1的pekinenal，陰性對照組加等量PBS液，培養(yǎng)48 h后撈片。按說明書經(jīng)TUNEL法染色后，蘇木精輕度復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明樹膠封片，鏡檢。光鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈黃褐色。10×10低倍鏡下隨機(jī)選取5個細(xì)胞均勻分布的視野，10×20中倍鏡下每個視野隨機(jī)選50個細(xì)胞計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目和總的細(xì)胞數(shù)目，計算凋亡指數(shù)(AI)。AI/%=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4透射電鏡觀察pekinenal對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響為觀察給藥后SMMC-7721細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以 6.25、12.5、50 μmol·L-1pekinenal處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞48 h，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，與培養(yǎng)液一起離心，棄上清，含體積分?jǐn)?shù)為0.025的戊二醛固定液固定細(xì)胞團(tuán)塊2 h，0.1 mol·L-1PBS洗滌3次，含體積分?jǐn)?shù)為0.01的鋨酸固定2 h，0.1 mol·L-1PBS洗滌3次，梯度濃度酒精、丙酮脫水，618環(huán)氧樹脂浸透包埋,超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察，拍照片。

2.5流式細(xì)胞術(shù)分析藥物對SMMC-7721細(xì)胞周期的影響將制備好的細(xì)胞分組后，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇的濃度加入pekinenal，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為0.05的飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。含體積分?jǐn)?shù)為0.0025的胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞離心1 000 r·min-1×10 min，棄上清液，將離心出的細(xì)胞PBS洗滌2次，1 000 r·min-1×10 min離心后，吸盡上清液，用200 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，分別加入10 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI混勻，避光4 ℃反應(yīng)30 min，再加入300 μL結(jié)合緩沖液，立即于流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3結(jié)果

3.1pekinenal對SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用由不同濃度pekinenal作用SMMC-7721細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖抑制率的結(jié)果由Tab1可見，MTT法檢測結(jié)果表明，pekinenal對肝癌SMMC-7721細(xì)胞有明顯增殖抑制的作用，該作用具有劑量依賴性，即隨著藥物作用劑量的增加，對細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)。根據(jù)Tab1可見，當(dāng)藥物濃度為25 μmol·L-1時，抑制率已過半，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取6.25、12.5和50 μmol·L-13個濃度觀察細(xì)胞周期和凋亡。

*P<0.05，**P<0.01vscontrol

3.2pekinenal誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡不同濃度pekinenal作用SMMC-7721細(xì)胞48 h后，收集對照組和藥物組細(xì)胞，Annexin V/PI 染色檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果如Fig 1和Tab2所示，6.25、12.5和50 μmol·L-1的pekinenal作用后，細(xì)胞的凋亡率分別為(12.13±0.03)% 、(28.02±0.1) % 和(72.34±0.1)%，呈劑量依賴性，與對照組比，差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01 )。

3.3TUNEL法觀察藥物作用48 h后對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響選擇6.25、12.5和50 μmol·L-1的pekinenal作用于SMMC-7721細(xì)胞，48 h后用TUNEL法檢測細(xì)胞核的染色情況。光鏡下觀察凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈塌陷固縮，被染上深褐色(Fig 2)?？瞻讓φ战M幾乎沒有細(xì)胞核被染上深褐色，因此在蘇木精復(fù)染時被染上了淡紫色。在藥物組中，由于染色過程中一些非特異性吸附，也有較多細(xì)胞被染上褐色，但是仔細(xì)鑒別可以發(fā)現(xiàn)，只有凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核不但染成深褐色，而且顏色深，體積較小，符合凋亡時細(xì)胞核固縮的特征。計算凋亡指數(shù)(AI)后顯示，不同濃度的pekinenal均能引起細(xì)胞凋亡，而且隨著濃度的增高，凋亡率明顯增加。

3.4電鏡觀察結(jié)果空白對照組未能檢測到凋亡細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組檢測到凋亡細(xì)胞存在，其超微結(jié)構(gòu)如Fig 3所示。從照片上可以看出，正常SMMC-7721細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，核膜完整，核染色質(zhì)顆粒細(xì)致，分布均勻。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)固縮，呈斑狀及塊狀聚集在核膜周邊，胞質(zhì)濃縮，核膜皺折，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，出現(xiàn)透明的空泡。

A:Control group; B: Treated with 6.25 μmol·L-1pekinenal; C: Treated with 12.5 μmol·L-1pekinenal; D: Treated with 50 μmol·L-1pekinenal

**P<0.01vscontrol

A: Control group; B: Treated with 6.25 μmol·L-1pekinenal; C: Treated with 12.5 μmol·L-1pekinenal; D: Treated with 50 μmol·L-1pekinenal.**P<0.01vscontrol

3.5pekinenal對SMMC-7721細(xì)胞周期的影響6.25、12.5 和 50 μmol·L-1的pekinenal作用SMMC-7721細(xì)胞48 h后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析，結(jié)果顯示，不同濃度的pekinenal均能使S期細(xì)胞的比例明顯升高，G1/G2期細(xì)胞的比例下降，細(xì)胞被阻滯于S期。見Tab3、Fig 4。

*P<0.05，**P<0.01vscontrol

4討論

惡性腫瘤共同的生物學(xué)特征為失控性生長，其主要分子機(jī)制是由于細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致細(xì)胞增生過多和凋亡減少，因此抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及凋亡已成為腫瘤治療的重要手段之一[1]。原發(fā)性肝癌是世界上死亡率第三的惡性腫瘤，由于我國大量乙型肝炎感染人群的存在，肝癌在我國高發(fā)，治療效果一直不理想[6]。近年來，順鉑等新化療藥物的應(yīng)用雖然大大提高了腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，但臨床治療效果仍然不甚滿意[7]。中草藥作為我國傳統(tǒng)藥物，以其藥物溫和、毒性作用小的特點(diǎn)，受到臨床的廣泛關(guān)注和應(yīng)用?，F(xiàn)今越來越多的研究證實(shí)，中藥提取物在抗腫瘤方面有著不容忽視的作用。

A: Control group;B: Treated with 6.25 μmol·L-1pekinenal；C: Treated with 12.5 μmol·L-1pekinenal；D: Treated with 50 μmol·L-1pekinenal

A: Control group; B: Treated with 6.25 μmol·L-1pekinenal；C: Treated with 12.5 μmol·L-1pekinenal；D: Treated with 50 μmol·L-1pekinenal

大戟屬植物中富含的二萜類化合物具有很強(qiáng)的生物活性，有報道指出二萜是五類最有希望的抗癌活性成分之一。賈忠建等[8-9]對從大戟屬植物準(zhǔn)葛爾大戟、甘遂大戟、甘青大戟等種植物中得到的千金二萜烷型和巨大戟烷型二萜單體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)對肝癌SMMC-7721、肺腺癌L342、胃腺癌MGc80-3的生長有明顯增殖抑制作用。劉桂芳等[10]對狼毒大戟中的二萜內(nèi)酯類成分進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明其二萜內(nèi)酯類均有不同程度抑制S180、艾氏腹水癌及肝癌腹水等癌細(xì)胞生長的活性。大戟注射液具有抑制癌細(xì)胞DNA合成作用，對于正常人骨髓粒單細(xì)胞集落(GM-CFU)的抑制作用明顯低于高三尖杉酷堿的抑制作用。文成英等以大戟注射液為實(shí)驗(yàn)用藥，對KY821細(xì)胞株及12例正常人骨千細(xì)胞進(jìn)行體外藥物實(shí)驗(yàn)，尚溪堿等對L615白血病小鼠進(jìn)行了體內(nèi)的藥物實(shí)驗(yàn)研究，觀察細(xì)胞動力學(xué)，實(shí)驗(yàn)證明了大戟注射液具有抑制癌細(xì)胞DNA合成作用[11]。二萜類化合物pekinenal是從京大戟中分離提取出的活性物質(zhì)，但對其抗癌作用機(jī)制至今尚未報道。

本研究通過MTT法發(fā)現(xiàn)，pekinenal對肝癌SMMC-7721細(xì)胞株的增殖有明顯抑制作用。隨著pekinenal濃度的增加，對SMMC-7721細(xì)胞株的抑制率逐漸上升，說明它的抑制作用具有一定的劑量依賴性。細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、消退等存在著密切的聯(lián)系。肝癌的迅速生長是癌細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控失衡的結(jié)果。誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡是肝癌治療的重要方法之一。本研究通過TUNEL法、Annexin V/PI染色檢測和電鏡觀察了pekinenal對肝癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明， pekinenal能誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，且隨著pekinenal濃度的增加，SMMC-7721 細(xì)胞凋亡率隨之增加，呈明顯的濃度依賴性。另外，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，UL(壞死細(xì)胞)比例上升幅度并不明顯，這說明pekinenal主要是對細(xì)胞的正常凋亡起作用，因此該藥物可能能夠減少臨床應(yīng)用上的一些副作用。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn), pekinenal作用后使SMMC-7721細(xì)胞S期比例增高，而G1和G2期細(xì)胞比例下降； 說明pekinenal抗肝癌的作用可能是通過抑制癌細(xì)胞DNA合成，將SMMC-7721細(xì)胞周期阻滯在S期而實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，本研究證明 pekinenal可使人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞被阻滯于S期，抑制其增殖；通過誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡等，發(fā)揮其抗肝癌作用，為進(jìn)一步研究該藥的抗腫瘤機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究中心、中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心完成，均此致謝！)

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JiangSuProvince,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Effects of diterpenoid pekinenal ofEuphorbiapekinensisRupr.on proliferation，cell cycle and apoptosis of hepatoma cells

CHEN Fei-yan1,TAO Wei-wei1,2,3, CHEN Kou-yu2,ZHANG Jia-qing2, WANG Yu-qing2, CHEN Gang2, DUAN Jin-ao3

(1.ResearchCenterofBasicMedicalCollege, 2.KeyLaboratoryofIntegrativeBiomedicineofBrainDiseases,SchoolofBasicBiomedicalScience, 3.CollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationof

Key words:EuphorbiapekinensisRupr;pekinenal; SMMC-7721；cell proliferation; cell cycle; cell apoptosis

Abstract:AimsTo study the effects of diterpenoid pekinenal ofEuphorbiapekinensisRupr. on cell proliferation, cell cycle phase and apoptosis of hepatoma SMMC-7721 cells and to probe into its anti-cancer mechanisms.MethodsMTT assay was used to investigate the effect of pekinenal on proliferation of SMMC-7721 cells; TUNEL method, Annexin V/PI staining and electron microscopy were employed to observe the cell apoptosis; Flow cytometry was applied to analyze the distribution of cell cycle.ResultsProliferation of SMMC-7721 cells was markedly inhibited by pekinenal in a dose-dependent manner; Annexin V/PI staining showed that with the increase of pekinenal concentration, apoptotic rate of SMMC-7721 cells increased significantly, compared with control group, the difference has significant statistical significance(P<0.01). TUNEL method test results showed that different concentrations of pekinenal in SMMC-7721 cells could induce liver cancer cell apoptotic and apoptotic index(AI) increased significantly (P<0.01) with the increase of drug concentration. Compared with control group, electron microscope found that after the treatment, hepatocyte mitochondrial swelling, endoplasmic reticulum expansion, cytoplasm inclusion body formation, part of the nucleus apoptosis, and the more obvious apoptosis appeared with the increase of drug concentration. Flow cytometry analysis showed that different concentrations of pekinenal could all make the cell block in S phase.ConclusionPekinenal has an obviously inhibitory effect on the human liver cancer cells, and there is significant concentration dependence; Pekinenal probably inhibits cancer cell DNA synthesis for the human liver cell cycle arrest in S phase and inhibits the proliferation . It plays a role in liver cancer inhibition by inducing liver cancer cells apoptosis, etc.

收稿日期:2015-12-18修回日期:2016-02-04

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項(xiàng)目(No 2011CB505303);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81403041; 81274199);江蘇省自然科學(xué)基金青年基金(No BK20140961)

作者簡介:陳飛燕(1988-)，女， 碩士， 初級實(shí)驗(yàn)師，研究方向：中藥抗腫瘤，Tel: 025-85811959, E-mail：feiyan88121@163.com; 陶偉偉(1984-)，男，博士，助理研究員，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，通訊作者,E-mail:tw845@163.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.016

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0519-05

中國圖書分類號：R284.1；R329.24；R329.25；R329.28；R735.702.2

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.032.html