劉小鶯吳　莉,陳　洲,劉禮斌

(福建醫(yī)科大學(xué) 1.附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科福建省內(nèi)分泌研究所、2. 老年健康研究院、3.藥學(xué)院, 福建 福州　350001)

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PTEN抑制劑對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響

劉小鶯1,2吳莉1,2,陳洲3,劉禮斌1,2

(福建醫(yī)科大學(xué) 1.附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科福建省內(nèi)分泌研究所、2. 老年健康研究院、3.藥學(xué)院, 福建 福州350001)

摘要：目的PTEN抑制劑對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響。方法原代內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定，CCK8檢測(cè)細(xì)胞生存率，實(shí)驗(yàn)分為正常組(C)、高糖組(HG)，PIC處理組(PIC)。C組糖濃度為5.6 mmol·L-1(C組)，HG濃度為30 mmol·L-1(HG)，PIC組過(guò)氧釩(PIC)濃度為10、100 nmol·L-1，預(yù)培養(yǎng)半小時(shí)后加高糖。流式細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞凋亡，β-半乳糖苷酶染色試劑盒(SA-β-Gal)染色測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定p16、PTEN基因表達(dá)，Western 印跡檢測(cè)總PTEN p16蛋白表達(dá)水平。結(jié)果高糖降低內(nèi)皮細(xì)胞生存率，高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PTEN基因及蛋白表達(dá)增加，增加β-半乳糖苷酶染色性陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)， p16、PTEN基因及蛋白表達(dá)增加。PIC增加高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞生存率，降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞p16、PTEN基因及蛋白的表達(dá)。高糖可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，PIC降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率。結(jié)論適當(dāng)濃度PTEN抑制劑降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老。高糖作用時(shí)間6 d可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，PIC降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率。

關(guān)健詞：內(nèi)皮細(xì)胞；PTEN；p16；細(xì)胞衰老；PI3K-AKT；高糖

糖尿病是心血管疾病的致病因素之一[1]。細(xì)胞不可逆的生長(zhǎng)停滯的狀態(tài)為衰老，糖尿病主要特征是高血糖，高糖可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老[2]。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處內(nèi)皮細(xì)胞與非斑塊處的內(nèi)皮細(xì)胞相比，呈現(xiàn)出衰老細(xì)胞的特征，血管內(nèi)皮細(xì)胞在衰老過(guò)程中，分泌的各種生物活性因子也在發(fā)生變化，如內(nèi)皮依賴性血管舒張因子合成下降、炎性因子合成增加、黏附因子表達(dá)增多等[3]。細(xì)胞的老化加快動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[4]。

PTEN(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten)是具有脂質(zhì)和蛋白雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，去磷酸化PIP3，生成PIP2，負(fù)調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號(hào)通路[5]。高糖抑制PI3K-AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是PTEN依賴性[6]。過(guò)氧釩(PIC)是蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制劑，低劑量就可以和PTEN酶結(jié)合，抑制其活性[7]。PI3K-AKT信號(hào)通路與細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)，抑制PI3K-AKT使細(xì)胞處于G1期，誘導(dǎo)纖維細(xì)胞衰老[8]。因此，研究PTEN抑制劑對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老相關(guān)細(xì)胞衰老的影響，為糖尿病血管并發(fā)癥提供治療的新思路。

1材料與方法

1.1材料內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基購(gòu)自Sciencecell ；0.025 g·L-1胰酶，膠原酶Ι購(gòu)自GIBCO；CCK8，β-半乳糖苷酶(β-gal)試劑盒購(gòu)自碧云天；Annexin-V-FLUOS 染色試劑盒購(gòu)自Roche公司；RNAprep Pure總RNA提取試劑盒試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega 公司，SYBR Premix Ex Taq 定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量試劑盒，HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司；PTEN、 p16 抗體購(gòu)自CST公司；過(guò)氧釩(PIC)購(gòu)自Merck公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)取當(dāng)天剖腹產(chǎn)新鮮臍帶10～15 cm，0.01 g·L-1膠原酶Ι消化內(nèi)皮細(xì)胞，37℃消化15 min。收集所有消化液，1000 r·min-1離心 15 min，棄上清，加入 4 mL培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到塑料培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%，胰酶消化細(xì)胞，取2～6代細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。

1.2.2原代內(nèi)皮細(xì)胞簽定FⅧ因子免疫組織化學(xué)染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為正常組、實(shí)驗(yàn)組、PIC處理組，正常組糖濃度為5.6 mmol·L-1(C組)，實(shí)驗(yàn)組糖濃度為30 mmol·L-1(HG)，PIC處理組的PIC濃度分別為1、10、100、1000 nmol·L-1(PIC)，PIC預(yù)培養(yǎng)0.5 h后加入高糖，各組作用時(shí)間為2、4、6 d，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。選取合適的高糖處理時(shí)間和PIC處理濃度。

1.2.4CCK8檢測(cè)細(xì)胞生存率96孔板每孔加入100 μL 105個(gè)細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，450 nm測(cè)定吸光度。

1.2.5β-半乳糖苷酶染色試劑盒(SA-β-Gal)測(cè)定細(xì)胞衰老衰老細(xì)胞在pH 6.0時(shí)有高β-半乳糖苷酶活性，以X-Gal為底物催化下會(huì)生成深藍(lán)色產(chǎn)物。顯微鏡下可以看到藍(lán)色的表達(dá)β-半乳糖苷酶的陽(yáng)性細(xì)胞。6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，室溫固定15 min，每孔加入1 mL染色工作液，37℃孵育6 h，顯微鏡下觀察。計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.6FITC- PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率參照Annexin-V-FLUOS 染色試劑盒說(shuō)明書操作：細(xì)胞分組干預(yù)后，用胰酶(0.25%，不含EDTA)消化處理細(xì)胞，1000 r·min-1離心5 min,收集細(xì)胞沉淀，PBS清洗2遍后，加入500 μL FITC/PI試劑盒緩沖液重懸細(xì)胞，取300 μL懸液于流式管中，分別加入FITC 3 μL、PI 3 μL，避光15 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定RNAprep Pure總RNA提取試劑盒，電泳結(jié)果顯示出清晰的28 S和18 S兩條帶，且28 S>18 S，Rromega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA產(chǎn)物(按Rromega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行)，SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)在LightCycle熒光PCR儀上測(cè)定,引物分別是：目標(biāo)基因p16 5′-CCCCACTACCGTAAATGTCCA-3′;5′-TG CTCACTCCAGAAAACTCCAA-3′目標(biāo)基因PTEN5′-TCAGGCGAGGGAGATGAGA-3′,5′-GACGAAGAGGA GGCGAGAAA-3′ PTEN 目標(biāo)基因P21 5′-TCAAAT CGTCCAGCGACCTTC-3′;5′-CATGCCCTGTCCATAG CCTCTAC-3′內(nèi)參基因(GAPDH)的擴(kuò)增效率一致，不同試驗(yàn)組內(nèi)參基因GAPDH相差1～2個(gè)循環(huán)，利用2-△△CT方法進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.8Western blot檢測(cè)總PTENp16蛋白水平：收集細(xì)胞，裂解液裂解，4℃，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣緩沖液稀釋各樣品蛋白，95℃變性5 min后上樣。先后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉過(guò)夜后，分別加入PTEN、p16一抗4℃振蕩過(guò)夜，TBST洗5 min×3次，加入HRP標(biāo)記的二抗常溫孵育1 h，ECL法顯影，應(yīng)用凝膠成像分析儀測(cè)定蛋白條帶灰度后，計(jì)算各蛋白條帶和內(nèi)參照β-actin 的比值。

2結(jié)果

2.1內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)3 h后開(kāi)始貼壁，24 h完全貼壁，早期貼壁細(xì)胞呈短梭形，細(xì)胞多成團(tuán)生長(zhǎng)，少數(shù)細(xì)胞分散生長(zhǎng)；2～3 d后細(xì)胞單層鋪滿呈鋪路石樣生長(zhǎng)(Fig 1)。內(nèi)皮細(xì)胞FⅧ抗原相關(guān)染色鑒定，F(xiàn)Ⅷ是由因子FⅧ促凝成分(FⅧ∶C)和內(nèi)皮細(xì)胞合成的vWF(von Willebrand factor)組成的一種復(fù)合物，F(xiàn)Ⅷ抗原陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)中可見(jiàn)染成棕褐色的顆粒，取3～5代的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。Fig 1A原代培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞形態(tài)(×200);Fig 1B細(xì)胞免疫化學(xué)染色法鑒定HUVECs(×400)，胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色顆粒細(xì)胞為FⅧ抗原陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。

A：Morphology of HUVEC(×100)；B：Identification of HUVEC by FⅧ immunochemical staining

2.2CCK-8測(cè)定細(xì)胞的生存率Fig 2A： HG組不同時(shí)間點(diǎn)高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生存率的影響，以C為對(duì)照組，30 mmol·L-1高糖降低內(nèi)皮細(xì)胞生存率,并隨時(shí)間延長(zhǎng)降低，作用2、4、6 d生存率分別為86.5%±3.5%、73.5%±5.1%、65.4%±4.6%(P<0.01，n=5)；Fig 2B: PIC 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生存率的影響，與C組相比，1000 nmol·L-1PIC降低內(nèi)皮細(xì)胞生存率，生存率為76.2%±3.7% (P<0.01，n=5)，其它濃度PIC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生存率沒(méi)的影響；Fig 2C: 以C對(duì)照組，不同濃度 PIC 預(yù)培養(yǎng)0.5 h后，30 mmol·L-1高糖作用4 d對(duì)細(xì)胞生存率的影響，與高糖作用組相比，10、100 nmol·L-1PIC可以增加高糖作用內(nèi)皮細(xì)胞的生存率(P<0.01，n=5)。

2.3PTEN抑制劑對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響根據(jù)CCK8結(jié)果實(shí)驗(yàn)分為以C組、高糖處理組(HG)、PIC 10 nmol·L-1+高糖處理組、PIC 100 nmol·L-1+高糖處理組，作用時(shí)間為6 d。流式結(jié)果顯示C、HG、PIC 10 nmol·L-1+高糖處理組、PIC 100 nmol·L-1+高糖處理組凋亡率分別為(10.2±1.06)%、(28.64±1.83)%、(16.40±1.86)%、(15.40±1.16)%，高糖作用內(nèi)皮細(xì)胞6 d，細(xì)胞的凋亡率增加，PIC 10 nmol·L-1+高糖處理組、PIC 100 nmol·L-1+高糖處理組降低高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。與C組相比，HG組P<0.01；PIC組與HG相比，P<0.01；PIC 10 nmol·L-1+高糖處理組、PIC 100 nmol·L-1+高糖處理組相比差異沒(méi)有顯著性，n=3。如Fig 3所示。

A:Different time of high glucose on endothelial cell survival rate; B:Influence of different concentration of PIC on endothelial cell survival rate;C: Influence of different concentration of PIC on high glucose induced endothelial cell survival rate.**P<0.05vsHG

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG

2.4PTEN抑制劑對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響實(shí)驗(yàn)分為C組、高糖處理組(HG)、PIC 10 nmol·L-1+高糖組、PIC 100 nmol·L-1+高糖組，作用時(shí)間為4 d。 A圖顯示SA-β-Gal染色：衰老細(xì)胞表達(dá)綠色陽(yáng)性細(xì)胞，HG組較C組SA-β-Gal的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，PIC 10 nmol·L-1+高糖組、PIC 100 nmol·L-1+高糖組較HG組SA-β-Gal的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低。B圖顯示定量PCR結(jié)果： HG組較C組p16 mRNA表達(dá)增加(3.3±0.6)倍，PIC 10 nmol·L-1+高糖組、PIC 100 nmol·L-1+高糖組較HG組p16mRNA分別降為(2.3±0.6)、(2.1±0.4)倍。C圖顯示W(wǎng)estern-blot蛋白灰度掃描結(jié)果：HG組較C組p16蛋白表達(dá)增加(2.7±0.4)倍，PIC 10 nmol·L-1+高糖組、PIC 100 nmol·L-1+高糖組較HG組p16蛋白表達(dá)分別降為(1.7±0.2)、(1.6±0.6)。如Fig 4所示。

A:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell senescence by SA-β-gal l staining;B:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell p16rnRNA expression;C:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell p16 protein expression.*P<0.05vsHG

2.5高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞PTENmRNA及蛋白的影響對(duì)照組(C)、高糖組(HG)72 h，定量PCR結(jié)果顯示HG組較C組PTENmRNA增加(2.7±0.6)倍；Western blot結(jié)果顯示蛋白灰度PTEN/Actin比較，HG組較C組PTEN蛋白表達(dá)增加1.81±0.23。如Fig 5所示。

*P<0.05vscontrol

3討論

細(xì)胞周期可分為G1、S、G2，M 4個(gè)時(shí)期，細(xì)胞周期停滯是細(xì)胞衰老的一個(gè)關(guān)鍵特征，研究發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞主要含有G1期的DNA，衰老細(xì)胞停滯于G1期，不能順利進(jìn)人S期，細(xì)胞不可逆的生長(zhǎng)停滯。p16基因是一種抑癌基因，在細(xì)胞周期的G1期調(diào)控中起重要作用，p16蛋白抑制細(xì)胞周期。G1-S期的轉(zhuǎn)化受Rb-p16-cdk4/6調(diào)控[9]。研究發(fā)現(xiàn), 細(xì)胞衰老時(shí), p16 表達(dá)明顯增高; 當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入p16 基因可出現(xiàn)衰老表型，因此p16 是細(xì)胞壽限的關(guān)鍵調(diào)控基因[10]。細(xì)胞衰老時(shí)乳糖苷酶活性增加，SA-β-Gal染色呈綠色陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組相比，高糖(30 mmol·L-1)作用內(nèi)皮細(xì)胞4 d，表達(dá)SA-β-Gal綠色陽(yáng)性細(xì)胞增加，p16mRNA 及蛋白表達(dá)增加，因此高糖作用內(nèi)皮細(xì)胞4 d可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老。

細(xì)胞衰老影響細(xì)胞膜完整性，細(xì)胞內(nèi)生成的自由基、不完全氧化產(chǎn)生的自由基攻擊細(xì)胞膜上的膽固醇和不飽和脂肪酸。產(chǎn)生的有毒分子導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖(30 mmol·L-1)作用內(nèi)皮細(xì)胞4 d內(nèi)皮細(xì)胞老化，作用6 d后細(xì)胞凋亡增加，存活率明顯下降。

研究表明高糖通過(guò)上調(diào)PTEN誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[11]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果高糖作用內(nèi)皮細(xì)胞4 d PTEN mRNA 及蛋白表達(dá)增加2倍以上，PTEN具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性，負(fù)調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞多種功能如細(xì)胞周期進(jìn)展，細(xì)胞遷移、擴(kuò)散和生長(zhǎng)[12]。PIC是PTEN的抑制劑，蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制劑，較小的劑量就可以抑制PTEN，調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號(hào)通路。PTEN抑制對(duì)損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用[13]，PTEN抑制劑能緩解內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷[14]。CCK8結(jié)果顯示，單獨(dú)0.1～100 nmol·L-1PIC作用低糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，0.1～100 nmol·L-1PIC內(nèi)皮細(xì)胞的生存率略增加，1000 nmol·L-1PIC對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用；高糖(30 mmol·L-1)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞4 d可以抑制細(xì)胞生存率，0.1 nmol·L-1PIC預(yù)培養(yǎng)不能改善高糖作用的內(nèi)皮細(xì)胞生存率，10、100 nmol·L-1預(yù)培養(yǎng)增加高糖作用的內(nèi)皮細(xì)胞生存率，100 nmol·L-1增加細(xì)胞生存率10 nmol·L-1沒(méi)有明顯區(qū)別，因此選擇10、100 nmol·L-1PIC為實(shí)驗(yàn)濃度，此濃度范圍能有效抑制PTEN并且對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。流式結(jié)果顯示，10、100 nmol·L-1PIC預(yù)處理可以降低高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。PTEN調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞p16的表達(dá)，PTEN敲除可以恢復(fù)老化和受損的胰島β細(xì)胞再生[15]。結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞p16受PTEN調(diào)節(jié)，10、100 nmol·L-1PIC使p16mRNA 及蛋白表達(dá)降低，SA-β-Gal綠色陽(yáng)性細(xì)胞減少。PTEN抑制劑可以降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老。

PTEN和p16是體內(nèi)的抑癌基因，體內(nèi)主要是起抑制腫瘤的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖作用內(nèi)皮細(xì)胞，抑癌基因表達(dá)增加誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，同時(shí)抑制腫瘤的發(fā)生。說(shuō)明體內(nèi)細(xì)胞在不良環(huán)境下，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，防止腫瘤的產(chǎn)生，這也是體內(nèi)的一種保護(hù)機(jī)制。

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PTEN inhibitors attenuates high glucose induced endothelial cell senescence

LIU Xiao-ying1,2, WU Li1,2, CHEN Zhou3, LIU Li-bin1,2

(1.FujianMedicalUniversityUnionHospitalEndocrinologyFujianInstituteofEndocrinology,Fuzhou350001,China; 2.ElderlyHealthResearchInstitute,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China; 3.FujianMedicalUniversityCollegeofPharmacy,Fuzhou350001,China)

Key words:endothelial cell; PTEN; p16; cell senescence; PI3K-Akt; high glucose

Abstract:AimTo study influence of PTEN inhibitors(PIC) on high glucose induced endothelial cell senescence Methods(1)HUVECs were cultured in ECM medium. Cell viability was determined by CCK-8. Cells were randomly divided into control group(C), high glucose group(HG), high glucose+10 nmol·L-1PIC group(HG+10 nmol·L-1PIC), high glucose+100 nmol·L-1PIC group(HG+100 nmol·L-1PIC). Cell apoptosis was examined by flow cytometry. Senescence Detection Kit was performed by SA-β-gal Cytochemical staining. The expression levels of genes and protein (p16 and Pten ) were detected by real-time PCR and Western blot. ResultsThe proliferation rate was markedly decreased in HG group compared with C group, and this phenomenon was reversed by PTEN inhibitors . Cell apoptosis was significantly increased in HG group compared with C group, and again these changes were blocked by PIC.The expression levels of genes (PTEN) were significantly higher in HG group compared with C group. The frequency of senescent (SA-β-Gal-positive) cells and the expression level of senescence genes (p16) were significantly higher in HG group compared with C group, and these changes were blocked by PIC. ConclusionThese results show that PTEN inhibitors(PIC) delays cellular senescence that is promoted under high glucose condition.

收稿日期：2015-12-15，修回日期：2016-02-13

基金項(xiàng)目：國(guó)家臨床重點(diǎn)?？评夏赆t(yī)學(xué)項(xiàng)目(No 2010306); 福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2014J01335)

作者簡(jiǎn)介：劉小鶯(1972-)，女，碩士，副主任技師，研究方向：糖尿病血管并發(fā)癥，E-mail:lxy666-123@163.com; 劉禮斌(1967-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病血管并發(fā)癥，通訊作者，Tel:0596-83357896-8452，E-mail:libin.liu@hotmail.com.

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.015

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)04-0514-06

中國(guó)圖書分類號(hào)：R329.25；R339.38；R394.2；R977.3；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.030.html