鄭海青 汪晶波 劉 丹 趙華鋒 佟剛強

(湖北省當(dāng)陽市中醫(yī)院檢驗科，宜昌444100)

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由CRISPR-Cas介導(dǎo)的細菌和古細菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)

鄭海青 汪晶波 劉 丹 趙華鋒 佟剛強

(湖北省當(dāng)陽市中醫(yī)院檢驗科，宜昌444100)

最新研究發(fā)現(xiàn)，微生物有一套以核酸為基礎(chǔ)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，這改變了之前研究者認為的微生物免疫系統(tǒng)僅局限于固有免疫系統(tǒng)的認識[1]。細菌與古細菌通過整合外源性核酸片段到宿主染色體成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR)一端，從而獲得對病毒及質(zhì)粒的抗性。本文對這種免疫系統(tǒng)的功能進行了總結(jié)，并討論了這種可遺傳的免疫系統(tǒng)的進化意義。

1 CRISPR的生物學(xué)特性

CRISPR最早由Ishino等[2]在1987年發(fā)表的對大腸桿菌iap基因3′下游序列的描述中觀察得到，但此后一直未能引起研究者的重視。直到2002年Jansen等[3]通過生物信息學(xué)方法在細菌和古細菌基因組中找出短重復(fù)序列以及與重復(fù)序列相關(guān)的基因，并正式將此種序列命名為“成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列”(CRISPR)，與其相關(guān)的蛋白編碼基因命名為CRISPR相關(guān)基因(CRISPRE associated genes,Cas)，有關(guān)CRISPR的相關(guān)研究才真正鋪展開來。隨后對CRISPR進行系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)是一個具有不同DNA重復(fù)片段(長度為20～50個堿基對)的超家族[4]，在重復(fù)片段的上游還具有cas基因，其編碼的Cas蛋白具有遺傳與功能的多樣性，且是CRISPR系統(tǒng)亞型分類的依據(jù)。盡管CRISPR重復(fù)序列具有多樣性，但大多數(shù)重復(fù)序列在3′-端都有一個保守的GAAA(C/G)基序，是一個或多個保守Cas蛋白的結(jié)合位點[5]。除了重復(fù)序列和間隔序列具有多樣性之外，CRISPR位點的數(shù)目及每個基因座的長度也是可變的。不同的CRISPR位點數(shù)及這些重復(fù)陣列的長度與基因組大小無關(guān)，一些最小的微生物基因組，如納米古細菌可包含多個CRISPR位點，且在一些基因組中，CRISPR可占染色體總量的1%以上，如硫化葉菌。重復(fù)序列-間隔序列-重復(fù)序列的模式是公認的CRISPR位點決定性特征[6]。富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的序列被稱為引導(dǎo)序列，往往位于CRISPR位點的兩側(cè)。比較分析顯示，最接近引導(dǎo)序列的間隔序列是最多樣的，離引導(dǎo)序列最遠的重復(fù)序列往往會被降解[7]。前導(dǎo)序列含有啟動子元件[5]和結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白的位點[8]，這對CRISPR RNA(crRNA)的表達與新序列的獲得至關(guān)重要[9]。CRISPR包括三種亞型：(1)Ⅰ型CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛分布于細菌和古細菌中[10]。Ⅰ型系統(tǒng)包括六個不同的亞型(A～F)，所有這些類型都編碼cas3基因。cas3包含一個N末端HD磷酸水解酶結(jié)構(gòu)域和C末端DExH解旋酶結(jié)構(gòu)域[11]；(2)Ⅱ型系統(tǒng)只存在于細菌中[12]，包括四個cas基因：cas9，cas1，cas2和csn2(Ⅱ-A型)或cas 4(Ⅱ-B型)。cas9基因是該系統(tǒng)的一大特點，它編碼一個大型多功能蛋白，這個蛋白既參與crRNA生物合成也參與入侵DNA的降解[13]；(3)目前已鑒定出兩個Ⅲ型系統(tǒng)(Ⅲ-A型和Ⅲ-B型)[14]，這些系統(tǒng)在古細菌中更為常見。Ⅲ-B型系統(tǒng)只能與其他CRISPR類型一起發(fā)揮作用。兩個Ⅲ型系統(tǒng)都能編碼cas10和cas6基因。Cas6是CRISPR特異性的核糖核酸內(nèi)切酶，Cas10則與目標(biāo)序列的干擾相關(guān)[15]。

2 CRISPR介導(dǎo)免疫的三個階段

CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫保護包括三個階段：CRISPR調(diào)節(jié)、crRNA生物合成及crRNA指導(dǎo)的干擾。在噬菌體侵入的初期，CRISPR/Cas復(fù)合物首先靶向裂解噬菌體基因組中的原型間隔序列，進而將其整合到宿主基因組中CRISPR 位點的5′-端。然后，這些原型間隔序列被轉(zhuǎn)錄成crRNA。最后，實現(xiàn)對入侵的噬菌體DNA 序列的干擾[16]。

2.1 CRISPR調(diào)節(jié) 大量研究表明，外源性DNA整合到CRISPR位點是一種普遍存在的現(xiàn)象，CRISPR轉(zhuǎn)錄子是噬菌體新型防御機制的核心組件，作用類似于真核生物的RNA干擾(RNA interference，RNAi)[17]。如Perez-Rodriguez等[18]從酸奶樣品中分離到兩種不同的噬菌體，感染嗜熱鏈球菌后篩選到九株噬菌體抗性的突變株。所有突變株都含有1～4個新的間隔序列，且這些新間隔序列均整合到了CRISPR位點的引導(dǎo)序列端，這表明間隔序列是提供免疫保護的關(guān)鍵所在，從而證實了噬菌體的抗性可通過在CRISPR位點插入或刪除噬菌體靶向間隔來達到增強或削弱的目的。雖然間隔序列的整合機制仍然尚不明確，但基于研究者對嗜熱鏈球菌和大腸桿菌的研究，目前已鑒定出了幾種參與該過程的Cas蛋白。如Babu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Cas1和Cas2是參與整合過程的保守核酸酶。值得注意的是，Cas1和Cas2的過表達足以在大腸桿菌BL21(DE3)染色體的內(nèi)源性CRISPR位點前導(dǎo)序列端添加新的間隔序列重復(fù)單元[20]。目前，前導(dǎo)序列端的準(zhǔn)確識別機制尚不明確，但可以肯定的是，前導(dǎo)序列的突變能夠阻斷轉(zhuǎn)錄且不干擾整合；與此相反，引導(dǎo)序列的前60個核苷酸的突變可使整合終止。引導(dǎo)序列的前60個核苷酸是必需的，但至少有一個重復(fù)序列，整合過程才會發(fā)生。除了Cas1和Cas2外，大腸桿菌I-E型的CRISPR系統(tǒng)還包括六種其他的Cas蛋白。雖然這些蛋白并非是獲得新序列的必需蛋白，但當(dāng)系統(tǒng)中存在這些蛋白質(zhì)時，新序列的獲得模式會發(fā)生變化[21]。如Swarts等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌系統(tǒng)中有完整的8種(類型I-E家族)cas基因，CRISPR位點往往通過獲得多個新的間隔序列而增大。第一個間隔序列的獲取往往會加速隨后的間隔序列的獲得，并且所有的間隔序列可來源于同一個DNA鏈。此外，噬菌體抗性水平的增加也與目標(biāo)特異性的間隔序列的數(shù)量相關(guān)；因此，對特定信號響應(yīng)的快速延伸的CRISPR位點的機制可限制噬菌體突變的機會。

2.2 CRISPR RNA的生物合成 2008年，Brouns等[23]確定了CRISPR特異性內(nèi)切核糖核酸酶Cas6e(以前稱作CasE或Cse3)對大腸桿菌(I-E型)中前體crRNA的處理，Cas6e是多樣性蛋白大家族中的一員，這個家族被稱為重復(fù)序列相關(guān)的神秘蛋白質(zhì)(Repeat-associated mysterious proteins，RAMP)。所有的RAMP蛋白都含有至少一種RNA識別基序(RNA recognition motif，RRM)和保守的富含甘氨酸的環(huán)(Glycine rich loop，G環(huán))。RRMs由一個保守的β1α1β2β3α2β4排列組成，其中β鏈組成了四條鏈反平行排列的β片層，兩個螺旋一起位于片層的一面[24]。這種折疊已在多種不同的RNA結(jié)合蛋白中發(fā)現(xiàn)，常常通過位于β-片層開放面的保守殘基結(jié)合RNA。Cas6e蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)揭示了兩個結(jié)構(gòu)域組成一個N端和C端的RRM[25]。一個富含脯氨酸的短接頭連接兩個結(jié)構(gòu)域，β-片層中的各個RRM面之間則形成蛋白質(zhì)表面上的V形槽。這個裂縫最初預(yù)測是RNA結(jié)合面，但Cas6e與crRNA結(jié)合的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)揭示了一個非典型的結(jié)合機制，涉及到序列和結(jié)構(gòu)的特異性相互作用，主要是位于蛋白的相反面。大腸桿菌CRISPR的重復(fù)序列部分回文，產(chǎn)生一個具有穩(wěn)定7 nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA，有一個由GCGU四環(huán)組成的帽子結(jié)構(gòu)。Cas6e C-末端結(jié)構(gòu)域帶正電的β-發(fā)夾與RNA雙鏈體的大溝相互作用，且位于蛋白質(zhì)帶正電裂縫的3′-鏈磷酸骨架上[26]。RNA結(jié)合誘導(dǎo)構(gòu)象的變化，從而破壞莖的底部堿基對，并且發(fā)生在酶活性位點伸展構(gòu)象的易斷裂磷酸上。切除機制是不依賴金屬離子的，并且發(fā)生在莖的基部，產(chǎn)生一個有5′-羥基和2′,3′-環(huán)狀磷酸酯的成熟crRNA。成熟的crRNA(～61 nt)由32-nt的間隔序列相鄰的5′-端8-nt的重復(fù)序列(也稱為5′手柄)和21個核苷酸的3′端的21-nt的剩余重復(fù)序列組成的。Cas6e仍然綁定到3′-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)作為召集大型監(jiān)測復(fù)合物-CRISPR內(nèi)切核糖核酸酶復(fù)合體(CRISPR ribonuclease complex，Cascade)的核點，這是免疫系統(tǒng)下一步沉默靶基因所必需的[27]。

2.3 CRISPR RNA指導(dǎo)的干擾 所有的crRNAs都可與Cas蛋白聯(lián)系形成大的CRISPR相關(guān)的核糖核蛋白復(fù)合物，但這些復(fù)合物是如何在擁擠的含有大量非目標(biāo)核酸(非靶RNA和DNA)的胞內(nèi)環(huán)境中找到與crRNA互補的短目標(biāo)序列的呢？研究表明，許多DNA結(jié)合蛋白能夠用比純粹的隨機碰撞高得多的手段定位它們的同源結(jié)合位點。一些蛋白質(zhì)通過靜電吸引到帶負電荷的糖-磷酸主鏈，進而非特異結(jié)合到DNA上加速靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。最初的結(jié)合后往往發(fā)生分子內(nèi)易位，被稱為一維滑動。與耗能馬達蛋白(即聚合酶、解旋酶、錯配修復(fù)酶和Ⅰ型限制性內(nèi)切酶)的定向運動相反，DNA滑動是熱擴散驅(qū)動的能源獨立的過程[28]。然而，DNA的初步結(jié)合是一個沒有引導(dǎo)的過程，受到一維擴散的限制。因此，一個包括3D組件的搜尋過程可加速靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。所有CRISPR系統(tǒng)目標(biāo)的識別都包括crRNA-間隔區(qū)序列與互補核酸靶序列的雜交。大腸桿菌的crRNA引導(dǎo)監(jiān)視復(fù)合物為Cascade，其可優(yōu)先結(jié)合到長的負超螺旋雙鏈DNA(質(zhì)?；蚴删wDNA)上[29]。負超螺旋壓縮雙鏈DNA，從而1D距離很遠的序列可在3D空間位置上接近，從而大大加快了雙鏈DNA結(jié)合蛋白的搜尋過程[30]。此外，負超螺旋狀態(tài)，有利于鏈的分離。如Westra等[31]最近發(fā)現(xiàn)負超螺旋提供了分離32 nt雙鏈DNA大約一半的能量。crRNA間隔序列的前8個核苷酸對靶標(biāo)的結(jié)合最為重要。crRNA間隔序列區(qū)域被認為是種子序列，并且與種子序列互補的靶序列的單核苷酸突變會導(dǎo)致嚴(yán)重的結(jié)合缺陷。與此相反，即使靶標(biāo)上非種子序列出現(xiàn)多個錯配，仍可進行高親和力結(jié)合，并可在噬菌體感染期間發(fā)揮正常作用[32]。

3 CRISPR介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫及其應(yīng)用

在篩選噬菌體抵抗的嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus,S.thermophilus)過程中，Barrangou等[32]首次闡明S.thermophilus對噬菌體產(chǎn)生的抵抗作用是由其CRISPR從噬菌體基因組中獲得新的間隔序列而得到的，這種與噬菌體DNA高度同源的片段一旦整合進入細菌基因組DNA中便產(chǎn)生了具有該噬菌體特異性抗性的菌株。此后Garneau等[33]研究發(fā)現(xiàn)S.thermophilus亦能從外源性質(zhì)粒中獲得間隔序列，從而通過RNA介導(dǎo)的Cas蛋白特異性地清除質(zhì)粒，產(chǎn)生對該質(zhì)粒免疫的菌株。

CRISPR介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)與哺乳動物相較，都具有特異性、多樣性以及記憶性這三大特征。CRISPR系統(tǒng)通過將與噬菌體、病毒或者外源質(zhì)粒同源的片段整合進間隔序列中，以此獲得相應(yīng)的特異性清除噬菌體、病毒或質(zhì)粒DNA的能力。同時通過將不同來源的DNA片段整合進入間隔序列，細菌由此實現(xiàn)CRISPR適應(yīng)性免疫的多樣性。并且由于新的間隔序列直接整合進入基因組當(dāng)中，該免疫特性得以在細胞分裂過程中予以保留并最終實現(xiàn)免疫記憶[34]。

CRISPR的應(yīng)用目前主要集中于生物醫(yī)藥及發(fā)酵奶制品菌種改造和分子生物技術(shù)兩方面。事實上，CRISPR在S.thermophilus中作用機制的闡明便得益于工業(yè)化生產(chǎn)中對噬菌體抗性菌株的強烈需求，由此推動了相關(guān)分子機制的研究，并由此在生產(chǎn)實踐中對工業(yè)上生產(chǎn)用菌株進行改造，通過CRISPR篩選獲得對噬菌體等病毒具有抗性的菌株，達到減少生產(chǎn)過程中噬菌體污染的所帶來經(jīng)濟損失的目的[35]。除此之外，CRISPR作用機制發(fā)現(xiàn)的更大意義在于其帶給分子生物學(xué)領(lǐng)域的重大技術(shù)革新，CRISPR/Cas9在基因編輯上的優(yōu)勢使其迅速得到應(yīng)用并與RNAi技術(shù)并列成為日常實驗中哺乳動物基因敲除手段之一[36]。甚至于中國科學(xué)家最近使用CRISPR/Cas9技術(shù)成功地對人廢棄胚胎β球蛋白基因進行了敲除，雖然這一實驗引起了世界范圍內(nèi)的巨大爭議，但仍然應(yīng)該看到CRISPR/Cas9在未來進行人類疾病基因治療的潛力[37]。

4 結(jié)論與展望

20世紀(jì)80年代，海洋病毒學(xué)家報道，1升海水中含有大約一百億個噬菌體，而這些病毒被普遍認為是地球上最豐富多樣的生物，這些病毒帶來的選擇壓力對微生物群落的組成和行為產(chǎn)生深遠的影響，微生物宿主已經(jīng)進化形成了不同的機制來逃避感染[38]。除了以限制修飾和受體轉(zhuǎn)變?yōu)榇淼南忍旆烙鶛C制外，近八年的研究發(fā)現(xiàn)微生物還有一套以核酸為基礎(chǔ)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)-CRISPR。無論從論文數(shù)還是論文質(zhì)量來看，CRISPR無疑是近三年來的研究明星。隨著對CRISPR研究的深入，該系統(tǒng)的實際應(yīng)用價值將會愈發(fā)凸顯。

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[收稿2015-09-07 修回2015-12-23]

(編輯 張曉舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.035

鄭海青(1975年-)，男，主管技師，主要從事微生物及分子免疫學(xué)相關(guān)研究，E-mail:ycdyzhenghaiqing@sina.com。

R37

A

1000-484X(2016)04-0605-04