幸　鵬　劉志剛　喻海瓊　夏立新

(深圳大學過敏反應與免疫學研究所，深圳518060)

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表觀遺傳機制和哮喘的發(fā)生①

幸鵬劉志剛喻海瓊②夏立新③

(深圳大學過敏反應與免疫學研究所，深圳518060)

支氣管哮喘是由多種細胞，特別是肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞參與的最常見的慢性氣道炎癥疾病[1]，易感者表現為反復發(fā)作性咳嗽、喘鳴和呼吸困難，并伴有氣道高反應性的可逆性、梗阻性呼吸道疾病[2]。最近的數據表明，哮喘和過敏性疾病的患病率不斷提高，過敏性疾病嚴重影響患者的生活、工作，同時也大大加重了患者家庭和社會的經濟負擔。在1942年，CH Waddington學者就首次提出“Epigenetics”，并描述表觀遺傳學主要研究基因型和表型之間的關系[3]，研究顯示，支氣管哮喘的發(fā)生與環(huán)境因素和遺傳密切相關，而表觀遺傳調控在遺傳和環(huán)境因素之間起著非常重要的媒介作用，是參與許多疾病發(fā)展的一個潛在調控機制，包括過敏性疾病。動物模型表明：環(huán)境因素，如孕婦吸煙或暴露于機械通風的排煙環(huán)境中可以改變胎兒基因的轉錄，進而影響胎兒肺的結構和功能。

表觀遺傳機制介導的基因組適應環(huán)境變化和表遺傳學改變可以促進疾病表型的發(fā)展，且可以作為可遺傳變異[4]。在Ivana V.Yang的研究中發(fā)現,長期暴露在污染空氣、煙草煙霧等環(huán)境中的人群與其表觀遺傳標志的改變有密切的關聯(lián)，同時也增加了發(fā)生哮喘的風險，表觀遺傳標志與細胞調節(jié)機制在空間和時間上的協(xié)同作用共同調節(jié)基因的表達水平[5]。DNA甲基化的異常，組蛋白修飾的失調以及microRNA的異常表達會影響參與免疫介導的肺部疾病相關基因的轉錄活性，這將影響T細胞的分化、增殖及肌成纖維細胞的活化，導致炎性細胞因子的過量表達和在細胞外基質的過度積累。表觀遺傳學主要是研究DNA序列沒有發(fā)生變化而基因的表達卻發(fā)生了可遺傳改變[6，7]，這些遺傳改變包括：DNA的甲基化、組蛋白的修飾和microRNA的異常表達等；總的來說，這三個主要的表觀遺傳機制都在不同水平上影響DNA和轉錄因子的結合、轉錄的穩(wěn)定性、DNA的折疊、核小體的定位、染色質壓縮以及基因沉默或激活[8]，這些調控機制都參與靶基因的轉錄后調控[9]。近年來，針對支氣管哮喘與表觀遺傳標志關系的研究已有較多的報道，現綜述如下。

1DNA的甲基化

DNA甲基化是表觀遺傳機制中第一個被確認和研究最廣泛的機制[10]；也是目前在哺乳動物中發(fā)現唯一的對DNA本身的遺傳編碼的修飾[4]。作為最常見的表觀遺傳修飾形式，DNA的甲基化是調節(jié)基因組功能的重要機制，它可通過直接影響轉錄因子與DNA的結合而抑制基因的表達[11]，因此DNA甲基化的改變可以影響細胞因子等表達相關的基因，導致T細胞的分化及反應性發(fā)生改變，從而與免疫性疾病的發(fā)病機制密切相關。DNA甲基化在Th2細胞因子的表達和Th細胞的發(fā)育過程中起著重要的控制作用，Janson等人發(fā)現IL-4基因啟動子發(fā)生去甲基化時，原始T細胞會向Th2方向分化[12]。真核生物的甲基化是CpG二核苷酸的胞嘧啶的第五個碳原子，以S-腺苷甲硫氨酸作為供體，在DNA甲基轉移酶的作用下，添加上一個甲基基團而變?yōu)?-甲基胞嘧啶，從而引起基因組中相應區(qū)域染色質結構變化，使DNA失去限制性內切酶的切割位點，以及DNA酶的敏感位點，使染色質高度螺旋化、凝縮成團，最終失去轉錄活性[13]。DNA甲基化可通過下列途徑使基因沉默：①5-甲基胞嘧啶伸入到DNA雙螺旋的主溝進而干擾轉錄子與啟動子的結合；②甲基-CpG集合區(qū)蛋白選擇性的與甲基化的啟動子結合形成復合物，阻斷轉錄因子的結合部位；③啟動子區(qū)甲基化CpG與甲基-CpG集合區(qū)蛋白特異性結合，后者再與組蛋白去乙酰基轉移酶結合形成復合物，結果使核心組蛋白尾部去乙酰化，形成更加緊密的DNA包裝，減少轉錄因子暴露其相應順式元件結合部位[14]。一般認為，DNA的甲基化會引起基因沉默，對基因的表達起著下調作用，而DNA去甲基化則會解除基因沉默的抑制作用，對基因的表達起著上調作用，DNA甲基化及去甲基化，再加上組蛋白修飾作用，直接影響著基因的活化狀態(tài)。

有研究表明，由于環(huán)境因素的作用，過敏性哮喘的患病率上升速度遠遠超過了人類遺傳背景基因序列的變化，這樣的環(huán)境刺激包括飲食和營養(yǎng)：膳食甲基供體和輔因子，如葉酸、維生素B12、B2、B6和鋅，這些都是DNA甲基化所必需的，并且可以改變過敏性氣道疾病的遺傳風險[15]。其中，葉酸是嘌呤、嘧啶和氨基酸的合成等許多生物反應所必需的。在DNA的合成中，葉酸是脫氧尿苷酸甲基化為胸腺嘧啶所需要的，這也是正常細胞分裂所必需的。以5-甲基四氫葉酸狀態(tài)存在的葉酸為SAM(S-腺苷甲硫胺酸)的結構提供必要的甲基供體，它也是DNA甲基化所需要的普遍的甲基供體。除了在DNA甲基化中的作用，葉酸還具有與哮喘和過敏性疾病相關的抗氧化作用[16]。其他的一些環(huán)境因素也會對DNA甲基化產生上調作用，如暴露于外源性化學物質、孕婦的行為、煙草煙霧和心理壓力，尤其是孕婦產前暴露于煙草煙霧中與在胎盤、臍帶血以及兒童整體的異常甲基化有密切關聯(lián)。在Tamar等[17]人的研究中發(fā)現，哮喘發(fā)生途徑中基因甲基化的改變與暴露在炭黑(是一種交通車輛污染物顆粒標志)和硫酸鹽顆粒環(huán)境中有密切關聯(lián)。Alan等[18]發(fā)現在兒童中，β-2腎上腺素受體(ADRB2)的5′非翻譯區(qū)可以作為哮喘嚴重程度的一個生物標志物。Nadeau和他的同事在研究生活在相對污染的Fresno區(qū)和加利福尼亞環(huán)境相對清潔的Stanford區(qū)的哮喘兒童，發(fā)現暴露在空氣污染更嚴重區(qū)兒童的叉狀頭轉錄因子P3(forkhead box P3)的DNA甲基化概率大大升高，并且其調節(jié)性T細胞(T-regulatory)受損[19]。值得一提的是DNA甲基轉移酶抑制劑，例如:5氮-雜胞苷(Aza)，在卵清蛋白(OVA)致敏小鼠模型中能夠通過增加調節(jié)性T細胞的數量，提示Aza具有治療哮喘的潛在優(yōu)勢[20]。

2組蛋白修飾

組蛋白是真核生物染色質中富含正電荷的精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸的結構小分子蛋白質，包括核心組蛋白H2A、H2B、H3、H4以及起連接紐扣作用的H1蛋白。DNA雙螺旋鏈是由組蛋白緊密纏繞而形成的具有高度組織的染色質結構，富含正電荷堿性氨基酸的核心組蛋白與帶負電荷的DNA具有高度親和性，可以阻止轉錄因子進入啟動子的結合位點，從而抑制轉錄。在組蛋白尾部特定的位點和殘基上發(fā)生的甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化通過調節(jié)RNA聚合酶Ⅱ和轉錄因子與DNA的結合，從而控制基因的表達。例如，組蛋白H3K4的三甲基化(H3K4me3)與轉錄激活強烈關聯(lián)，然而，組蛋白H3K27的三甲基化(H3K27me3)常與基因沉默相關[5]。同樣的，組蛋白N末端賴氨酸殘基在組蛋白乙?；傅淖饔孟卤灰阴；够蜣D錄活化；而組蛋白N末端賴氨酸殘基在組蛋白去乙?；傅淖饔孟旅撘阴；鶎е禄虺聊?。由組蛋白甲基轉移酶或組蛋白去甲基根據甲基基團的數目，可逆地調節(jié)組蛋白賴氨酸或者精氨酸的甲基化，有助于染色質的壓縮或松弛[21]。Cheng-ye Li等[22]研究發(fā)現，與正常對照組相比，哮喘患者外周血中T細胞表達的T細胞銜接活化因子(Linker for activated of T cells,LAT)的mRNA有所降低。LAT啟動子組蛋白的低乙酰化可以抑制LAT的表達和增強Th2的分化，而一種組蛋白乙酰化抑制劑——曲古抑菌素A可以促進LAT的表達并且抑制Th2細胞因子的產生。因此，LAT的表達對哮喘的發(fā)生也是非常重要的。

在哮喘患者中，組蛋白乙?；梢酝ㄟ^能激活T細胞或者LAT的鏈接介質調節(jié)T細胞的活力(LAT是一種選擇性誘導T細胞激活的關鍵膜相關的接頭蛋白)。在OVA免疫的過敏性氣道炎癥的的大鼠模型中，其組蛋白H3和H4的乙?；斤@著降低，且在mRNA和LAT蛋白水平降低的LAT上游區(qū)，H3K9二甲基化顯著增加從而導致Th2細胞的極化。與此同時，用曲古抑菌素A(TSA)治療能逆轉LAT啟動子區(qū)組蛋白H3、H4的低乙?；瘡亩訌娏薒AT的表達并抑制了Th2細胞因子的產生。此外在哮喘患中，T細胞活化的調控、組蛋白的修飾也可以通過血管內皮生長因子(VEGF)介導支氣管血管的重塑。Clifford等人[20]發(fā)現相比于非哮喘平滑肌(HASM)細胞，哮喘病人平滑肌(HASM)細胞的VEGF 165b在mRNA和蛋白水平的表達量都增加了。目前很少有替代糖皮質激素治療哮喘的藥物，Cristan Herbert等[23]在輕度慢性哮喘和急性發(fā)作哮喘的小鼠模型中，對一種新的蛋白質藥物(ISU201)評估發(fā)現，ISU201能顯著降低氣道上皮細胞中組蛋白H4的乙?；Ｒ虼?，ISU201是一種氣道炎癥和氣道重塑的廣譜抑制劑，可能成為替代或輔助糖皮質激素治療哮喘的藥物。

3MicroRNAs

MicroRNAs(miRNAs)是一類由內源基因編碼的長度約為20個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[24]，其主要作用是通過干擾mRNA的3′端非編碼區(qū)，從而在翻譯水平上調節(jié)基因的表達。通過miRNA干擾的基因沉默是影響生物體的發(fā)育和內環(huán)境穩(wěn)定的一種表觀遺傳機制[16]；MicroRNAs在哺乳動物細胞的增殖和分化起著重要的作用(在人類基因組中，大約有60%的mRNAs都是由miRNAs靶向調控的[24])，然而miRNAs水平上的異常變化會引起細胞功能的變化，進而誘發(fā)疾病[25]。miRNAs在調節(jié)免疫平衡中的關鍵作用也受到越來越多的關注，microRNAs在過敏性疾病、腫瘤和感染等疾病中起著重要的作用。過敏性氣道疾病的特點是炎癥細胞的浸潤和呼吸道高反應性，最近的研究發(fā)現哮喘患者的miRNA表達譜已有改變，miRNAs水平的異常上調或下調是構成哮喘發(fā)生內在機制的重要組成部分。

Tsitsiou等[26]學者通過對重度和非重度哮喘患者外周血CD8+T細胞中miRNAs表達譜差異研究發(fā)現激活的外周血CD8+T細胞中miR-146a/b和miR-28-5p的表達顯著下調，提示這與重癥哮喘的發(fā)生密切相關。與對照組相比，哮喘組的miR-21、miR-106a、miR-221、miR-181a、miR-150、miR-146a、miR-146b等的水平增加，而let-7降低，這些miRNAs分別通過不同的靶點來調節(jié)炎癥的發(fā)生，在實驗性哮喘的模型中，miR-21是一個經常上調的miRNAs。已有文獻報道它的靶點是IL-12p35，并能抑制IL-12p35表達，而miR-21的下調可誘導樹突狀細胞產生更多的IL-12和CD4+T細胞，以增加IFN-g和降低IL-4的量，因此，miR-21主要調節(jié)Th1與Th2的細胞應答[20]。Jude等[27]人通過熒光素酶報告基因分析，發(fā)現miR-140-3p也是一個下調miRNAs，它可以調節(jié)CD38的表達。Chilba等[28,29]學者通過關于miR-133a與支氣管平滑肌(ASM)收縮研究發(fā)現：miR-133a的抑制劑能夠促進支氣管ASM收縮的一種重要因子-RhoA蛋白的表達，且IL-13能夠通過STAT6非依賴的機制直接抑制人支氣管平滑肌細胞表達miR-133a。也就是說IL-13可以通過下調支氣管平滑肌細胞表達miR-133a從而促進RhoA蛋白的表達，進而引起平滑肌收縮[26]。所以上調miR-133a的表達為治療支氣管哮喘患者氣道高反應提供了一種新思路。在哮喘患者的HASM細胞中，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導CD38的表達升高，而miR-140-3p誘導的CD38的表達則顯著下降。這說明在HASM細胞中，CD38是miR-140-3p的一個靶點且TNF-α誘導表達CD38也是受到miR-140-3p的調節(jié)。根據這些miRNAs的作用靶點，在基因調節(jié)和疾病模式上，目前也有能力應用個體miRNAs作為治療的手段，針對哮喘的氣道高反應的miRNAs治療可以達到抗炎癥的反應[19]。

4結語

哮喘是一種與遺傳密切相關的氣道炎癥性疾病，他的發(fā)病機制非常復雜，目前公認的機制涉及免疫學、內分泌、遺傳學及環(huán)境學等。有越來越多的研究表明，表觀遺傳機制參與了哮喘和過敏性疾病的發(fā)展[15]。對表觀遺傳學進行研究，使其成為和環(huán)境暴露、藥物及過敏性疾病發(fā)病機制之間相關聯(lián)的橋梁，這可能尋找到研究哮喘的新通路。在不久的將來表觀遺傳潛在的修飾作用可以為降低過敏性疾病和哮喘發(fā)生找到新方法[30]。雖然哮喘的表觀遺傳學現仍處于起步階段，盡管現面臨更多的挑戰(zhàn)，但是表觀遺傳分析提供了一個認識哮喘發(fā)生、發(fā)展和治療的新平臺。在當前臨床醫(yī)生面臨激素抵抗性哮喘束手無策的狀況下，利用miRNAs進行干擾哮喘的發(fā)生及治療等方面的研究可能為支氣管哮喘的防治提供新的治療選擇。

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[收稿2015-06-03修回2015-07-07]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.036

作者簡介：幸鵬(1990年-)，男，碩士，主要從事過敏反應與免疫學基礎研究，E-mail:xingpeng_2005@126.com。

中圖分類號R593.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0757-04

①本文為國家自然科學基金(81273275)；深圳市科創(chuàng)委基礎研究項目(No.JCYJ20120613173233810)。

②深圳福田人民醫(yī)院，深圳518033。

③通訊作者，E-mail:xialixin@126.com。