陳信忠郭書林龔艷清蘇亞玲楊俊萍孔繁德（.海峽兩岸農產品檢驗檢疫技術廈門中心　福建廈門　36026；2.廈門市海洋與漁業(yè)研究所）

對蝦急性肝胰腺壞死綜合征病原研究進展

陳信忠1郭書林1龔艷清1蘇亞玲2楊俊萍1孔繁德1
（1.海峽兩岸農產品檢驗檢疫技術廈門中心福建廈門361026；2.廈門市海洋與漁業(yè)研究所）

對蝦急性肝胰腺壞死綜合征是近幾年的新發(fā)現疫病，嚴重影響對蝦產業(yè)發(fā)展。本文對該病病原的研究進展以及最新檢測技術進行了綜述。目前大多數學者認可該傳染病的病原是副溶血性弧菌的特異菌株，并研究建立了針對該菌株的PCR檢測方法。有關該菌株的致病機理以及準確的診斷方法還有待深入研究。

對蝦早期死亡綜合征；病原；診斷方法

1　前言

近年來，全球對蝦養(yǎng)殖產業(yè)不斷暴發(fā)以肝胰腺壞死為主要特征的傳染病，主要危害凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）和斑節(jié)對蝦（P.monodon），每年造成超過十億美元的經濟損失。由于該病不容易被發(fā)現，絕大部分對蝦在池底死亡，俗稱“偷死病”；同時由于該病主要發(fā)生于蝦苗放養(yǎng)后7-30 d，所以亦稱為早期死亡綜合征 （Early Mortality Syndrome，EMS）。該病最初于2009年在中國發(fā)生，隨后越南和馬來西亞分別在2010和2011年相繼報道了此疾病［1］；2012年初，泰國一些養(yǎng)殖場也發(fā)現了此疾?。?］；2013年初，該病蔓延到西半球的墨西哥。該病病情發(fā)展十分迅速，死亡率極高［3］。2013年全球養(yǎng)殖對蝦產量較2012年減少近四分之一，其中泰國下降約50%，我國自150萬t下降到130萬t，下降約17%［4］。2014年，我國對蝦養(yǎng)殖成功率仍然很低，發(fā)病率超過60%。為了滿足國內市場的需求，我國開始大量進口對蝦，從對蝦出口大國變?yōu)檫M口國，嚴重影響了我國對蝦產業(yè)發(fā)展。2013年初，確認該病病原是一種特殊的副溶血弧菌 （Vibrio parahaemolyticus），專業(yè)上，該病被稱為急性肝胰腺壞死綜合征（Acute Hepatopancreas Necrosis Syndrome，AHPNS）［5］。隨著病原研究的不斷深入，針對該傳染病的快速檢測方法也在不斷更新和完善，為有效預防和控制該傳染病提供了重要的技術支持。

2　病原的確認

2013年5月，國際水產聯盟（GAA）和聯合國糧農組織（FAO）先后宣布，導致AHPNS的病原體是副溶血弧菌的特異變種。該病原是一種罕見的副溶血弧菌，起初認為它被一種噬菌體病毒感染后發(fā)生變異，并促使細菌釋放強力毒素，不過后來的研究否定了“噬菌體與對蝦EMS的關系”，但確實存在特異的副溶血弧菌菌株。該細菌經口傳播并定植在對蝦消化道，產生的毒素引起肝胰腺等組織損壞，并造成對蝦肝功能紊亂及消化系統障礙［4］。

2014年，有關AHPNS的病原學研究取得了重要進展，在第九屆世界華人蝦蟹養(yǎng)殖研討會上，臺灣成功大學羅竹芳教授通過研究報告驗證了Lightner等研究團隊關于AHPNS與特異性副溶血性弧菌的相關性的研究［6］。通過比較副溶血性弧菌致病株與非致病株的基因序列，發(fā)現了與特異性副溶血性弧菌致病性相關的pVA1質體，該質體上帶有與桿菌屬相關的殺昆蟲毒素 （Photorhabdus insect-related，Pir）PirA和PirB。在自然缺乏或基因敲除此Pir毒素的試驗中，致病菌株明顯失去致病能力，證明副溶血弧菌的毒素蛋白PirA和PirB是引起AHPNS的關鍵。試驗表明，用PirA單獨感染可以導致對蝦肝胰腺細胞間出現一些小泡，但無明顯癥狀；PirB單獨感染時，對蝦肝胰腺上皮細胞出現大量脫落，與AHPNS癥狀吻合度極高；而PirA和PirB同時感染對蝦，則出現AHPNS癥狀。Pir毒素蛋白通過質?；蚍g而來，可是目前尚無法知道該質粒如何進入對蝦體內，有可能源于其他物種，因為PirA和PirB與一些植物中發(fā)現的毒素蛋白同源性極高，與蘇云金桿菌Cry insecticidal毒素的結構也類似 （蘇云金桿菌可以使昆蟲致死）。有關PirA和PirB的作用機理尚不明確，PirA可能起某種調控作用。

隨后又有多項報告證明AHPNS是由副溶血弧菌引起。雖然尚不清楚是否所有的AHPNS都是由一個或多個特定的副溶血弧菌菌株引起，但通過控制弧菌可以大大減少AHPNS暴發(fā)的風險［7-9］。Kongrueng等［10］（2014）對來自泰國的副溶血弧菌菌株進行了溶血性、毒力基因、血清型、基因型和以及抗生素敏感性的研究，所有導致AHPNS的菌株都有一個獨特的O抗原，但來自不同養(yǎng)殖場的菌株其K抗原有一些小的變化。此外，由感染AHPNS的對蝦肝胰腺分離的菌株基本相似，但與醫(yī)學臨床和自然環(huán)境的分離株有所不同，因此推論AHPNS菌株可能源于同一菌株，隨后發(fā)展出略有不同的血清型。

Tran等［5］（2013）通過純培養(yǎng)分離到AHPNS的病原體，人工浸泡感染實驗可以誘發(fā)實驗蝦典型的AHPNS病理變化并導致100%死亡，人工誘導的AHPNS病變與自然感染的AHPNS組織病變完全相同。該菌株已被確定為哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）進化枝的成員，大部分與副溶血弧菌關系密切。

Soto-Rodriguez等 （2015）［11］對墨西哥發(fā)生的AHPNS進行細菌學和組織學分析，通過不耐熱溶血素（thermo labile hemolysin，TLH）基因分析確認該菌株為副溶血弧菌。用該菌株進行浸泡感染，人工感染蝦出現了與養(yǎng)殖患病蝦相同的臨床和病理癥狀：嗜睡、空腸、肝胰腺呈灰白色和水化，以及膨大的色素細胞。利用組織學分析和細菌密度計數方法，感染蝦發(fā)生AHNPS可以分為初始期、急性期和晚期3個階段，在人工感染蝦和池塘養(yǎng)殖蝦都可以觀察到肝胰腺管狀上皮細胞嚴重脫落的特征性病變。結果還表明，不同副溶血弧菌菌株有不同毒力，一些低毒力菌株不會引起100%的死亡率，其死亡率上升速度也比更強的菌株更慢。同時菌株的毒力亦與感染量相關，感染濃度限量為104CFU/mL，低于該濃度時未觀察到死亡。

我國是最早發(fā)現AHPNS的國家，雖然一開始未能及時確認病原，但也有一些報告認為我國的對蝦傳染病可能與副溶血弧菌有關。黃倢等從全國各對蝦主產區(qū)采集的AHPNS病例中，分離到了12株副溶血弧菌，其中從北海的病蝦中分離到一株毒力高、抗藥性強的副溶血弧菌，該菌株具有VPP19高毒力蛋白。從其他一些細菌，如哈維氏弧菌和金氏發(fā)光桿菌也能檢出VPP19，且對對蝦表現出類似致病性［12］。

3　病原基因組及致病機理

副溶血性弧菌是世界各地河口、海洋和海岸環(huán)境的原生性細菌，也是食源性腸胃炎的病原體?；诰w抗原（O）和莢膜抗原（K）的抗原屬性，至今世界范圍內已報告了超過80種血清型［13］。一些罕見的菌株可以引起人類胃腸疾病，這些菌株含有2個特殊的基因。目前已知該菌的主要致病因子包括耐熱直接溶血毒素（thermostable direct hemolysin，TDH）、耐熱直接溶血相關毒素 （TDH-related hemolysin，TRH）和3型分泌系統 （Type 3 secretion systems，T3SS）等。T3SS能夠將細菌感受器傳送到宿主細胞質，被認為可以引發(fā)細胞毒性和腸毒性。6型分泌系統（Type 6 secretion systems，T6SS）可能參與細胞內轉運和膜泡運輸，也可能有致病作用。此外，研究表明缺乏毒素和致病性相關基因的菌株也可能致病，表明還存在其他重要的毒力因子。至今在全球范圍內發(fā)生和分布的毒力因子的獨特性，表明副溶血弧菌的致病性與其動態(tài)變化的基因組一樣十分復雜。

導致AHPNS的副溶血弧菌菌株的基因組全序列已有報告。Gomez等［8］（2014）從墨西哥發(fā)病對蝦胃部分離到副溶血性弧菌菌株M0605，攻毒實驗證明該菌株能導致對蝦嚴重死亡。對該菌進行測序得到403，443 reads（平均179 bp），總計158.4 Mbp；經過聚類分析得到157個序列，基因組大小約5.650 Mbp；這些序列用RAST解釋，得到5152編碼序列（CDSs）和128 RNAs；有兩個染色體 （Ch），ChI約為3.356 Mbp（3145 CDSs），ChII約為1.767 Mbp（1609 CDSs）；ChI和ChII分別有5個和4個前噬菌體，大小約5.9-58.2 Kbp；兩個染色體上都發(fā)現有前噬菌體f237；檢測到4個質粒，分別為2個IncP、IncF和IncP；在兩個染色體上都發(fā)現了與致病相關的系統：血紅素、腸桿菌素、弧菌鐵素（vibrioferrin）和 2個TonB等5個鐵攝取系統，2個T2SS、1個T3SS、2個T2/4SS和2個T6SS等7個分泌系統；至少有14不同的毒素基因和9個溶血素；有數個蛋白酶，其中有3個鋅依賴蛋白酶，1個弧菌溶血素（vibriolysin），還發(fā)現5個幾丁質酶和1個Tfox幾丁質代謝調控因子；此外，還確認有一個IV型菌毛附著系統和一個莢膜多糖抗吞噬系統。

Yang等［7］（2014）對3株引起AHPNS的副溶血性弧菌菌株和1株不致病菌株的基因序列進行了比較。致病菌株3HP和5HP分離自泰國的凡納濱對蝦，中國株來自海南，非致病菌株S02來自泰國的蝦池沉淀物；菌株3HP、5HP、中國株和S02的基因組分別有100、82、144和97個序列，預計編碼DNA序列分別為5155、5148、4950和4946。4個菌株的ChI分別為3.360、3.362、3.190和3.244 Mbp，而ChII大約為1.872、1.871、1.755和1.927 Mbp。分別有113、107、113和102未翻譯的RNA序列；菌株3HP、5HP和中國株發(fā)現了與霍亂弧菌（V.cholerae）4個毒素基因同源的基因，這些毒素為閉合帶毒素（zonaoccludens）、副霍亂腸毒素、轉錄激活因子ToxR和跨膜調節(jié)蛋白ToxS，而菌株S02沒有這些基因。來自墨西哥的菌株M0605和來自泰國的2個AHPNS菌株，TUMSAT_DE1_S1和TUMSAT_DE2_ S2，也有同樣的4個基因，但來自泰國的另外一個菌株TUMSAT_D06_S3沒有發(fā)現這些基因。此外，在所有3株致病菌株還發(fā)現之前未曾報道的一個大型染色體外質粒 （～69 Kbp），但在非致病的菌株沒有發(fā)現。雖然這個與AHPNS緊密相關的質粒上大多數都是新基因，但也發(fā)現了一個編碼二元毒素PirAB同源的基因，該基因存在于具有殺蟲作用的桿菌中。序列信息表明，這種AHPNS質粒蛋白是一種孔蛋白（pore-forming protein），但目前尚不能確定該菌如何導致肝胰腺細胞快速死亡。

Kondo等［14］（2014）對3株引起AHPND的副溶血弧菌致病菌株和3株非致病性菌株進行基因測序，結果發(fā)現所有這些菌株均缺乏與人類感染有關的致病性基因島。在3株致病性AHPND菌株中發(fā)現了獨特的編碼IV型纖毛/IV型分泌系統的序列。

Joshi等［15］（2014）應用BLAST技術和特異性基因標記技術檢測特有的依賴卵磷脂溶血素（lecithin dependent hemolysin，LDH），鑒定出4個獨立的副溶血弧菌菌株。用其中3個菌株以及1個來自中國的菌株進行浸泡感染，結果引起極高的死亡率，肝胰腺表現明顯的AHPND組織病理學特征；用其中一個菌株5HP測試，結果表明死亡率依賴于感染劑量；使用同樣的感染方法，菌株2HP可以引起高死亡率，但未觀察到AHPND組織病理學變化，相反，它造成肝胰腺不同的組織病理學變化，包括上皮細胞脫落和獨特的胚胎細胞液泡化（E-cells）。該結果表明導致養(yǎng)殖對蝦早期死亡的不同副溶血弧菌菌株可能具有多樣性。

Tang等［16］（2014）對引起對蝦AHPND的副溶血弧菌菌株的毒素基因進行了研究。菌株13-028/A3含有3個類殺蟲毒素復合體（tc）基因，分別是編碼284 kda蛋白質的類tcdA基因（7710 bp）、編碼158 kda蛋白質的類tcdB基因（4272 bp）和編碼107 kda蛋白質的類tccC3基因（2916 bp）；所有3種預測蛋白質都含有各自特征性的Tc蛋白保守區(qū)域；通過RT-PCR實驗，該菌的所有3個類tc基因都可以表達。通過染色體步移技術和PCR擴增，將這3個基因進行拼接，在2號染色體位于tRNAGly旁邊的位置發(fā)現了一個基因島（87712 bp，稱為tc-GIvp）。該基因島在其他弧菌中沒有發(fā)現，其GC含量為40%。tc-GIvp的特點是含有60個編碼調控或致病因子的ORFs，包括6型分泌蛋白VgrG、EAL蛋白、菌毛亞單元和組裝蛋白、類侵襲素蛋白、肽聚糖結合蛋白和Tc蛋白；tc-GIvp還包含21個轉座酶基因，表明它是從其他生物通過水平轉移而來。

Han等［17］（2015）報告，上述菌株13-028/A3確認含有69 kb的質粒pVPA3-1，質粒的GC含量為45.9%。通過比較定量PCR分析，每個細菌含有37拷貝，由92個開放閱讀框組成，分別編碼轉運蛋白、復制酶、轉座酶、毒力相關蛋白以及桿菌屬相關毒素（Pir）。這些Pir類毒素蛋白由2基因編碼 （類pirA 和pirB），位于3.5 kb片段以內，兩側為編碼轉座酶的反向重復序列（1 kb）。這兩個基因的GC含量僅為38.2%，大大低于質粒其余部分的GC含量，表明這些基因很可能是最近才獲得。基于蛋白質組學分析，類pirA基因（336 bp）和類pirB基因（1317 bp）分別編碼13 kDa和50 kDa蛋白質。在實驗室條件下，菌株13-028/A3在培養(yǎng)基中可以產生這兩種蛋白質。

Sriurairatana等［18］（2014）報告發(fā)生AHPND的對蝦，其肝胰腺（HP）和中腸出現很多蛆形、簇狀小泡，導致出現白色成串的糞便，稱為白色糞便綜合癥（WFS）。用新鮮肝胰腺組織壓片并染色后觀察，肝胰腺小管腔中的小泡幾乎是透明的，也沒有細胞結構。透射電子顯微鏡（TEM）觀察，該小泡非層狀的外層膜與細胞質膜或任何已知的簇蟲、其他原生動物或后生動物的外膜均不相同，也沒有線粒體、細胞核、內質網和核糖體等亞細胞器。內膜具有管狀的次級結構，偶爾還包裹整個B細胞從肝胰腺小管上皮細胞脫落。這些內膜似乎來源于轉換的微絨毛，從肝胰腺小管上皮細胞剝離，然后聚集在小管腔。微絨毛的剝離，源自細胞的溶解。相比之下，B細胞保持完好，或被從小管上皮細胞完整地吞噬。如果被成簇透明的微絨毛（ATM）吞噬，光鏡下就會被誤認為囊狀結構，形成簇狀的外觀。出現成簇透明微絨毛的原因尚不明了，但微絨毛的損失以及隨后的細胞溶解作用表明其形成是一個病理過程。如果病變嚴重，可能會阻礙對蝦生長，使對蝦感染條件致病菌。

4　其他可能的病因

雖然大多數學者已經認可AHPNS主要由副溶血弧菌特異菌株引起，但亦不排除還有其他一些因素也能導致養(yǎng)殖對蝦表現相似癥狀。黃倢等［19］（2013）通過組織病理學、人工感染實驗、疑似病原基因進化分析、病毒分離純化和熒光原位雜交等研究手段，證實一種新型的野田村病毒是導致對蝦AHPNS的疑似病原，這種病毒被命名為對蝦偷死野田村病毒（Covert mortality nodavirus，CMNV）。進一步研究發(fā)現，CMNV與感染昆蟲類的類似病毒有較高的同源性，從多地患AHPNS的對蝦中都檢出了此前從未檢出的黃頭病毒（YHV）一個株型，這一基因型與現已發(fā)現的YHV 6個基因型均不相同；2006年澳大利亞學者從泰國的凡納濱對蝦中分離一株高毒力YHV的一個基因片段的缺失在此基因型中也存在，說明這個基因型對凡納濱對蝦可能具有較高的毒力。在感染實驗中，患病蝦勻漿液經微孔濾膜過濾的濾液能導致健康對蝦在數天內死亡。

龐德彬［20］（2014）認為藍藻產生的毒素可能引發(fā)AHPNS。水中的銅綠微囊藻、假魚腥藻、小顫藻等多種藍藻，由于各種原因死亡后會釋放出微囊藻毒素。該毒素能夠強烈抑制蛋白質活性、誘發(fā)肝臟腫瘤，而且可以專一地作用于對蝦的肝胰腺及腸胃等內部器官，引發(fā)肝胰腺腫大、變色、壞死及抽搐性跳水、側游、休克、沉底等中毒癥狀，引起空腸空胃。當微囊藻毒素在水體的濃度達0.4 μg/L以上時，即引發(fā)養(yǎng)殖對蝦急性死亡。在我國南方的對蝦養(yǎng)殖過程中，盛行肥水培藻養(yǎng)殖模式，很多蝦塘水體因為藍藻大量繁殖而呈綠色，因此相對于清瘦水、茶色水、褐色水的養(yǎng)殖水體更容易暴發(fā)AHPNS。

同樣的病理特征可能有不同的致病原因。顯然AHPNS也可能由多種不同的原因引起，細菌、病毒、有害理化因子、有毒藻類以及宿主抗逆性下降等都可能引起對蝦肝胰腺出現相似的病理變化。由于影響?zhàn)B殖水體的因素眾多，其中一些因素還可以互相影響，因此，很多時候AHPNS可能并非單獨由一種細菌引起，而是由多種細菌共同作用所致。何建國等在廣東、河北、廣西省、海南省等地采集具有“空腸空胃”等癥狀的 172尾病蝦的肝胰腺、腸道、血淋巴進行細菌分離，共收集1 435株細菌。經鑒定主要細菌及其感染率分別為：副溶血弧菌52.6%，蠟樣芽胞桿菌27.8%，霍亂弧菌23.7%，嗜水氣單胞菌19.6%，蘇云金芽胞桿菌17.5%，金橙黃微小桿菌14.4%。因此，雖然目前的研究表明特殊副溶血弧菌菌株是導致AHPNS的主要原因，但針對不同的養(yǎng)殖環(huán)境以及發(fā)病情況還需要考慮多方面的因素。

5　另一種相似的對蝦疫病

AHPNS與對蝦的另一種疫病——壞死性肝胰腺炎（Necrotising hepato pancreatitis，NHP）十分相似，兩者都表現為肝胰腺壞死和高死亡率。由于針對NHP的研究報告也很少，尚無法確定這兩種疫病之間的關系。2013年國際動物衛(wèi)生組織 （OIE）將NHP列入《水生動物疫病診斷手冊》中，其病原被稱為壞死性肝胰腺炎細菌（Necrotisinghepatobacterium，NHPB），又名類立克次體（rickettsial-like organism，RLO），其分類尚不明確，暫時被歸于變形菌綱，α亞綱［21］。主要感染凡納濱對蝦和藍對蝦（P. stylirostris），并導致很高的死亡率［22，23］。通過16S rRNA分析，NHPB與斑疹傷寒熱立克次氏體和斑點熱立克次氏體有83.5%的相似性。NHPB為革蘭氏陰性、多形態(tài)、專性細胞內寄生的細菌，分散存在于感染的肝胰腺細胞胞質內，存在桿狀和螺旋體狀兩種形態(tài)。對北美和南美爆發(fā)的NHP分離的NHPB菌株基因進行分析，發(fā)現兩者幾乎相同或為緊密相關的亞種。凡納濱對蝦感染NHPB可引發(fā)急性、毀滅性的傳染病，成蝦發(fā)病后死亡率較高。30 d內死亡率可達90%-95%［24］。如果水溫長時間超過29℃，或鹽度出現劇烈變化（20%-38%）可以增加NHPB的繁殖率。

6　小結

AHPNS是近年來新出現的傳染病，最初不同學者對發(fā)病原因有多種解釋，包括病毒、細菌以及藻類毒素等。通過對各種病原、種苗、水質、飼料、養(yǎng)殖管理等多方面的綜合研究，越來越多的實驗證明該病與副溶血性弧菌有關，目前大部分學者認為該病主要由副溶血性弧菌的特殊菌株引起。

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Progress of Pathogen for Acute Hepatopancreas Necrosis Syndrome

CHEN Xinzhong1，GUO Shulin1，GONG Yanqing1，SU Yaling2，YANG Junping1，KONG Fande1
（1.Inspection and Quarantine Technology Center of Cross-strait Agricultural Products in Xiamen，Xiamen，Fujian，361026；2.Xiamen Institute of Marine and Fisheries）

This paper deal with the progress of the pathogen and the latest detection technology for acute hepatopancreatic necrosis syndrome which causing mass death in recent years in shrimp.At present，most scholars recognized the pathogen of the disease is the special strains of Vibrio parahaemolyticus.The PCR detection method for this pathogen has been established.But the pathogenic mechanism and the accurate diagnosis method of this strain still need to be further studied.

Acute Hepatopancreas Necrosis Syndrome；Pathogen；Diagnosis Method

S944.4

E-mail：chenxz@xmciq.gov.cn

廈門市科技計劃項目 （2041S0437）

2015-08-20