胡霜霜，劉春生，童衛(wèi)杭，曹　淼，吳　城，彭　瓏，王　丹(第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100088)

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·論著·

用HPLC-MS/MS法檢測大鼠乳腺微透析液中環(huán)磷酰胺的濃度

胡霜霜，劉春生，童衛(wèi)杭，曹淼，吳城，彭瓏，王丹*(第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100088)

[摘要]目的：建立HPLC-MS/MS法檢測大鼠乳腺微透析液中環(huán)磷酰胺的濃度。方法: 采用Cosmosil-C(18)色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈，0～1 min A∶B=70∶30，1～1.5 min A∶B=60∶40，1.5～5.5 min A∶B=40∶60，5.5～8 min A∶B=70∶30，梯度洗脫8 min，流速為1 ml/min。正離子多反應(yīng)檢測(MRM)方式進行檢測，監(jiān)測離子對:環(huán)磷酰胺m/z 261.3→140.1，內(nèi)標安替比林m/z 189.2→104.0。結(jié)果:環(huán)磷酰胺的線性范圍為0.05～10 μg/ml，最低定量限為0.05 μg/ml。日間和日內(nèi)RSD均<15%，準確度和穩(wěn)定性實驗結(jié)果均符合生物樣品的測定要求。結(jié)論:本方法靈敏度高，操作簡便，適用于微透析樣品中環(huán)磷酰胺的濃度測定。

[關(guān)鍵詞]環(huán)磷酰胺；含量測定；微透析；色譜法，高效液相；質(zhì)譜法

[Pharm Care Res，2015，15(3): 205-207]

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)是臨床上最常用的一種烷化劑類抗腫瘤藥，廣泛用于治療惡性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等，具有一定的化療效果[1]。環(huán)磷酰胺是一個典型的前體藥物，體外無活性，在肝中被細胞色素P450氧化酶氧化，生成活化型的磷酞胺氮芥發(fā)揮抗腫瘤作用，屬細胞周期非特異性藥物。目前，國內(nèi)環(huán)磷酰胺血漿濃度的測定方法主要是GC法和HPLC法，但耗時較長，檢測限偏高。此外，血藥濃度結(jié)果不能準確反映靶標部位的治療情況。微透析技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新型活體靶標取樣技術(shù)[2]。本研究旨在建立HPLC-MS/MS法測定大鼠乳腺微透析液中環(huán)磷酰胺的濃度。

1材料

1.1儀器3200Q-Trap 型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源(ESI)和Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)處理軟件(美國Applied Biosystem 公司)；Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；XH-C 渦旋混合器(中國金壇市白塔新寶儀器廠)；CP225D分析天平(精度0.01 mg，德國Sartorius公司)。

微透析系統(tǒng)包括CMA150型動物保溫墊、CMA402型微量注射泵、MAB 85型低溫樣品收集器、CMA30 型線性微透析探針(分子截留值6 kU，透析膜長1 cm)，均購自美國CMA公司。

1.2試劑環(huán)磷酰胺對照品(批號100234-200502)和安替比林對照品(批號100506-200301，中國食品藥品檢定研究院)；注射用環(huán)磷酰胺(規(guī)格0.2 g/支，進口批號H20110407，百特國際有限公司)；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純；水為無菌去離子水；復(fù)方氯化鈉注射液(又名林格氏液，華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司)；水合氯醛(解放軍第三O六醫(yī)院生產(chǎn))；Veet脫毛膏(法國Veet公司)。

1.3實驗動物SD大鼠2只，體重(200±10) g，雌性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件Cosmosil-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸水，B相為乙腈，0～1 min A∶B=70∶30，1～1.5 min A∶B=60∶40，1.5～5.5 min A∶B=40∶60，5.5～8 min A∶B=70∶30，梯度洗脫8 min；流速：1.0 ml/min，分流比1∶1；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μl。

2.2質(zhì)譜條件離子源：ESI源，正離子模式檢測；離子噴射電壓：4500 V；離子源溫度：500 ℃；源內(nèi)氣體1(GS1,N2)壓力：241.4 kPa；氣體2(GS2,N2)壓力：241.4 kPa；氣簾氣體(N2)壓力：69 kPa；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；碰撞氣(N2)壓力：Medium；環(huán)磷酰胺、安替比林解簇電壓(DP)分別為48、57 V；碰撞能量(CE)分別為27、22 eV；環(huán)磷酰胺、安替比林用于定量分析的離子對分別為m/z261.3→140.1、189.2→104.0。

2.3溶液的配制(1)環(huán)磷酰胺儲備液的配制精密稱取10 mg環(huán)磷酰胺對照品，置于10 ml容量瓶中，加入乙腈溶解，定容至刻度，配制成濃度為1 mg/ml的環(huán)磷酰胺儲備液。(2)內(nèi)標溶液的配制精密稱取10 mg安替比林對照品，置于10 ml容量瓶中，加入乙腈溶解，定容至刻度，配制成1 mg/ml儲備液，再用乙腈稀釋成1 μg/ml的安替比林內(nèi)標溶液。

2.4標準曲線及質(zhì)控樣品的制備吸取適量環(huán)磷酰胺儲備液，用空白透析液(將探針植入大鼠乳腺組織，以林格氏液灌流，收集到的液體)稀釋成濃度為0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 μg/ml的系列對照品溶液。依次精密吸取各濃度的環(huán)磷酰胺對照品溶液20 μl，加入內(nèi)標溶液10 μl，混合渦旋10 s。吸取適量環(huán)磷酰胺儲備液，用空白透析液稀釋，按上述方法操作，制備含環(huán)磷酰胺濃度為0.1、0.8、8.0 μg/ml的質(zhì)控樣品。

2.5微透析樣品收集及處理

2.5.1探針體外校正以林格氏液沖洗探針后，將線性微透析探針浸入裝有100 ml林格氏液的微透析反應(yīng)瓶中，分別以不用濃度的藥物(cin，1.0、4.0、8.0 μg/ml)作為灌流液，其他條件不變，收集的樣品在所建立的HPLC-MS/MS條件下測定透析液中藥物濃度(cout)。通過減量法計算環(huán)磷酰胺的體外探針回收率，R=(cin-cout)/cin，結(jié)果為(53.32±1.23)%。

2.5.2微透析樣品收集大鼠用水合氯醛按體重(0.4 ml/100 g，ip)麻醉，腹部朝上固定于保溫墊上，使其體溫保持在37.5 ℃。用脫毛膏去除胸部毛，15 min后，暴露大鼠乳頭，用直尺準確量取探針透析膜進出的長度。將線性微透析探針用18 G穿刺針引導(dǎo)平行植入乳腺組織后，抽回引導(dǎo)針并將探針留于組織中，然后將探針與微透析裝置相連。以2 μl/ml的流速向其中泵入林格氏液作為灌流液，排除氣泡并沖洗管路30 min，再以1.0 μl/ml的流速向微透析探針中泵入林格氏液，平衡1 h后，收集空白透析液。將注射用環(huán)磷酰胺用生理鹽水溶解，尾靜脈注射給藥，一次性給予0.20 mg/g。以冷凍樣品收集器連續(xù)收集透析液，采樣間隔30 min，溫度4 ℃，持續(xù)采樣2 h。樣品處理：精密量取透析液樣品20 μl，加入內(nèi)標溶液10 μl，渦旋10 s，進樣2 μl。

2.6方法學(xué)考察

2.6.1專屬性考察空白透析液、環(huán)磷酰胺及內(nèi)標加入空白透析液的色譜圖、組織透析液色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。

2.6.2線性關(guān)系考察取環(huán)磷酰胺儲備液，用空白透析液稀釋成0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 μg/ml系列溶液，分別量取20 μl，加內(nèi)標溶液10 μl，混合渦旋10 s，進樣2 μl，進行HPLC-MS/MS分析。

以待測物濃度(X)為橫坐標，以待測物與內(nèi)標物的峰面積比(Y)為縱坐標進行線性回歸，得環(huán)磷酰胺回歸方程為Y=0.982X+0.012，r=0.999 2。結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺在0.05～10 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測限為2 ng/ml。

2.6.3精密度和準確度實驗按2.4項下方法制備環(huán)磷酰胺濃度分別為0.5、4.5、8 μg/ml的低、中、高濃度質(zhì)控樣品，每個濃度5份，隨行標準曲線回歸方程計算濃度，并計算日內(nèi)精密度和準確度。重復(fù)操作，連續(xù)測定3 d，考察方法的日間精密度和準確度，準確度=(平均值-理論值)/理論值×100%，結(jié)果見表1，表明此方法的精密度和準確度符合要求。

圖1　HPLC-MS/MS法測定大鼠乳腺微透析液中環(huán)磷酰胺(1)和內(nèi)標安替比林(2)的典型譜圖Figure 1　The typical photograms of cyclophosphamide(1) and internal standard antipyrine(2) in rat breast microdialysis fluid by HPLC-MS/MS methodA:空白透析液；B:空白透析液+環(huán)磷酰胺對照品(0.1 μg/ml)+內(nèi)標安替比林(1.0 μg/ml)；C:微透析液樣品;A1、B1、C1：環(huán)磷酰胺；A2、B2、C2:安替比林

2.6.4穩(wěn)定性實驗按2.4項下方法制備環(huán)磷酰胺濃度分別為0.5、4.5、8 μg/ml的低、中、高濃度質(zhì)控樣品，每個濃度各3個樣品，分別在4 ℃、室溫條件下放置10 h，-20 ℃反復(fù)凍融2次后，測試其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，測定值與理論值的RSD均<15%，表明透析樣品在上述條件下均較穩(wěn)定。

表 1　微透析樣品中環(huán)磷酰胺的精密度和準確度實驗結(jié)果

3討論

3.1檢測方法的選擇環(huán)磷酰胺能溶于水，但溶解度不大，完全溶解需時間長，且其水溶液不穩(wěn)定，對光和熱敏感[3]，因此，環(huán)磷酰胺的水溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。目前國內(nèi)主要使用HPLC、GC等方法測定血漿中環(huán)磷酰胺的濃度，存在耗時較長、靈敏度不高等不足。本研究采用HPLC-MS/MS法檢測環(huán)磷酰胺的濃度，由于環(huán)磷酰胺極性較大，所以在流動相洗脫時，需使用高比例的水相洗脫。本研究以梯度洗脫方式，采用正離子模式檢測，可使環(huán)磷酰胺出峰較好，信號穩(wěn)定。

3.2微透析樣品的選擇微透析技術(shù)可監(jiān)測靶部位組織細胞外的游離藥物濃度[4]，因此，監(jiān)測組織中藥物的濃度比傳統(tǒng)血藥濃度的定量結(jié)果更具預(yù)測性[5]。文獻報道，環(huán)磷酰胺普遍應(yīng)用于乳腺癌聯(lián)合治療方案中，在乳腺癌化療過程中占據(jù)著不可忽視的地位[1]。因此，本研究采用HPLC-MS/MS法檢測乳腺微透析液中環(huán)磷酰胺的藥物濃度，方法專屬性強，檢測限低，檢測時間短，可在8 min內(nèi)快速檢測出乳腺中環(huán)磷酰胺的藥物濃度，提供了一種快速有效監(jiān)測環(huán)磷酰胺藥物濃度的方法。

【參考文獻】

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Liu HongGuang, She JianTao, KangYing,etal. Influence of cyclical administration with low-dose cyclophosphamide and interleukin-2 on regulatory T cells of murine breast cancer model and its life span[J].Med Sci J Central South China,2013,41(4):353-356.In Chinese with English abstract.

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[修回日期]2015-06-06

[本文編輯]陽凌燕

Determination of cyclophosphamide in rat breast microdialysis fluid by HPLC-MS/MS method

HU ShuangShuang，LIU ChunSheng，TONG WeiHang，CAO Miao，WU Cheng，PENG Long，WANG Dan*

(Department of Pharmacy,Second Artillery General Hospital of PLA,Beijing 100088,China)

[ABSTRACT]Objective: To establish a HPLC-MS/MS method for the determination of cyclophosphamide concentration in rat breast microdialysis fluid.Methods：The analysis was performed on Cosmosil-C(18 )column(150 mm×4.6 mm,5 μm). The mobile phase was composed of 0.1% formic acid solution(A)-acetonitrile(B) in gradient elution at a flow rate of 1 ml/min，0-1 min A∶B=70∶30，1-1.5 min A∶B=60∶40，1.5-5.5 min A∶B=40∶60，5.5-8 min A∶B=70∶30.Selected positive ion multiple reaction monitoring(MRM) of m/z 261.3→140.1(cyclophosphamide) and m/z 189.2→104.0(internal standard antipyrine) was performed.Results:Calibration curves were linear over the range of 0.05-10 μg/ml for cyclophosphamide，the lowest detection limit was 0.05 μg/ml.Intra- and inter-day precisions were less than 15%.The results of accuracy and stability tests all met the requirements for the determination of biological samples. Conclusion：This method is sensitive and easy for operation,and could be used for the determination of cyclophosphamide in microdialysis samples.

[KEY WORDS]cyclophosphamide;content determination;microdialysis;chromatography,high performance liquid;mass spectrometry

[收稿日期]2014-12-11

DOI：10.5428/pcar20150314

[中圖分類號]R927.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-2838(2015)03-0205-03

作者簡介胡霜霜(女)，碩士生，藥師.E-mail：huss2008@126.com*通信作者(Corresponding author):王丹，E-mail:wdyy_618@sina.com

基金項目國家自然科學(xué)青年基金(81301662),中國博士后科學(xué)基金(2013M532151)