陳方劍，陸松偉，宋洪杰，高鴻彬，全山叢，駱錦前 (第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

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·論著·

用HPLC法測定珍珠維E乳膏中維生素B6和維生素E的含量

陳方劍，陸松偉，宋洪杰*，高鴻彬，全山叢，駱錦前 (第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

[摘要]目的：建立HPLC法測定珍珠維E乳膏中維生素B6和維生素E的含量。方法：維生素B6：Kromasil C(18)色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流 動 相：甲醇-0.04%庚烷磺酸鈉(用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0)=20∶80；檢測波長：291 nm。維生素E：ACE-121-1546 C(18)色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水=95∶5，檢測波長：285 nm。流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫。結(jié)果：維生素B6在5.000 5～100.01 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=1.000 0)，低、中、高濃度(標(biāo)示量80%、100%、120%)的平均回收率分別為(97.46±1.30)%、(99.00±0.34)%、(98.09±0.56)%(n=3)。維生素E在31.96～255.68 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，低、中、高濃度(標(biāo)示量80%、100%、120%)的平均回收率分別為(100.04±1.57)%、(100.02±0.30)%、(102.92±0.56)%(n=3)。精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、靈敏，專屬性強，重現(xiàn)性好，對珍珠維E乳膏質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提高具有參考意義。

[關(guān)鍵詞]珍珠維E乳膏；維生素B6；維生素E；含量測定；色譜法，高效液相

[Pharm Care Res，2015，15(3): 201-204]

珍珠維E乳膏是由尿素、維生素B6、維生素E、人參、川芎等制成的院內(nèi)特色制劑，在第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院皮膚科臨床使用多年，主治黃褐斑、雀斑、老年斑及日曬斑等皮膚病，療效顯著。珍珠維E乳膏原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅測定尿素含量，對反映藥效的維生素B6和維生素E 未建立質(zhì)控方法。本研究建立測定珍珠維E乳膏中維生素B6和維生素E含量的HPLC法，為提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1材料

1.1儀器LC-10ADVP高效液相色譜儀，包括LC-20AD泵、SPD-M20A二極管陣列檢測器、CBM-20A控制器和LC solution工作站(日本島津公司)；XS205DU十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；DL-720A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。

1.2試劑和藥品珍珠維E乳膏(第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部自制，批號131008、131104、131105)；維生素B6對照品(純度99.6%，大豐海嘉諾藥業(yè)有限公司，批號1205202)；維生素E對照品(純度97.0%，浙江醫(yī)藥股份有限公司，批號110405)；庚烷磺酸鈉(東京化成工業(yè)株式會社)；甲醇[色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；無水乙醇(江蘇省常熟市楊園化工有限公司)、冰乙酸[永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司]均為分析純；水為蒸餾水(本院藥學(xué)部自制)。

2方法和結(jié)果

2.1維生素B6的含量測定

2.1.1色譜條件色譜柱：Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流 動 相：甲醇-0.04%庚烷磺酸鈉(用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0)=20∶80；檢測波長：291 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μl。

2.1.2溶液的制備(1)對照品溶液：精密稱定100.01 mg維生素B6對照品置10 ml棕色量瓶中，加適量流動相超聲溶解，放冷后加流動相定容至刻度，搖勻即得10.001 mg/ml維生素B6對照品溶液。(2)供試品溶液：取珍珠維E乳膏約1 g，精密稱定，置100 ml燒杯中，加流動相30 ml，置99.5 ℃水浴中加熱，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓僦帽≈欣鋮s2 h后，用定量濾紙濾入100 ml量瓶中。同法提取3次。將濾液合并入100 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。濾液再用0.45 μm微孔濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液2.5 ml，置10 ml量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻后作為供試品溶液。由于甲醇有毒且易揮發(fā)，因此以上操作均在通風(fēng)櫥中快速完成，實驗人員須戴口罩。(3)陰性對照溶液：按本品處方制備不含維生素B6的空白乳膏，再按供試品溶液制備方法操作，得到陰性對照溶液。

2.1.3專屬性實驗按照2.1.1項下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液20 μl進(jìn)樣測定，得到色譜圖見圖1。由圖1可見，供試品溶液與對照品溶液在相同保留時間處有相同的色譜峰，而陰性對照溶液在此處無吸收峰，表明專屬性良好。

圖1　珍珠維E乳膏中維生素B6的HPLC譜圖Figure 1　HPLC photograms of vitamin B6 in Pearl vitamin E creamA：陰性對照溶液；B：對照品溶液；C：供試品溶液

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取2.1.2(1) 項下的維生素B6對照品溶液1 ml置100 ml棕色量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻即得100.01 μg/ml維生素B6對照品溶液。分別精密量取此溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 ml，置10 ml棕色量瓶中，加流動相稀釋，定容至刻度，搖勻，得到系列濃度為5.000 5、10.001、20.002、40.004、80.008、100.01 μg/ml的維生素B6對照品溶液。按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣20 μl，測定峰面積(A)，對濃度(c)進(jìn)行線性回歸，計算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=52 173c+2 858.5(r=1.000 0)，表明維生素B6在5.000 5～100.01 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度實驗(1)日內(nèi)精密度：精密吸取2.1.4項下濃度為20.002 μg/ml的維生素B6對照品溶液20 μl，按照2.1.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，由峰面積計算得到日內(nèi)RSD=0.64%(n=6)。(2)日間精密度：精密吸取2.1.4項下濃度為20.002 μg/ml的維生素B6對照品溶液20 μl，每天測定1次，連續(xù)測定5 d，根據(jù)峰面積計算得到日間RSD=0.77%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性實驗按2.1.2(2)項下方法制備供試品溶液，在0、2、4、6、8 h分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算得到RSD=0.75%(n=5)，表明供試品溶液在配制后8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7重現(xiàn)性實驗取同一批號(131008)珍珠維E乳膏樣品5份，按2.1.2(2)項下方法制備5份供試品溶液，以2.1.1項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積。計算得到維生素B6的含量為標(biāo)示量的97.77%，RSD=0.42%(n=5)，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.1.8回收率實驗精密稱定9份不含維生素B6的空白乳膏各1 g，分別加入已知濃度的維生素B6對照品適量，制備成維生素B6含量相當(dāng)于標(biāo)示量80%、100%、120%(80.008、100.01、120.012 μg/ml)的模擬樣品。按照2.1.2(2)項下方法制備供試品溶液，測定含量并計算回收率。結(jié)果低、中、高濃度的平均回收率分別為(97.46±1.30)%、(99.00±0.34)%、(98.09±0.56)%(n=3)。

2.1.9樣品含量測定取3個批號(131008、131104、131105)的珍珠維E乳膏，按2.1.2(2)項下方法制備供試品溶液，以2.1.1項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積。計算得到3個批號珍珠維E乳膏中的維生素B6含量分別為標(biāo)示量的(97.54±0.38)%、(93.27±1.67)%、(92.34±0.37)%(n=3)。

2.2維生素E的含量測定

2.2.1色譜條件ACE-121-1546 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水=95∶5；檢測波長：285 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2.2溶液的配制(1)對照品儲備液：精密稱取維生素E對照品0.319 6 g，置100 ml量瓶中，加無水乙醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為3.196 mg/ml的維生素E對照品儲備液。(2)供試品溶液：精密稱取珍珠維E乳膏約3.0 g，置燒杯中，加無水乙醇25 ml，置80 ℃水浴上加熱，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，再置冰浴中冷卻2 h后，用定量濾紙濾入100 ml量瓶中，同法提取3次。將濾液合并入量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。濾液再用0.45 μm微孔濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液2 ml，置10 ml量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，即得供試品溶液。(3)陰性對照溶液：精密稱取不含維生素E的空白乳膏約3.0 g，置燒杯中，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.2.3專屬性實驗按照2.2.1項下色譜條件，分別吸取維生素E對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μl進(jìn)樣測定，得到色譜圖見圖2。由圖2可見，維生素E與流動相峰分離清晰，表明專屬性良好。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

圖2　珍珠維E乳膏中維生素E的HPLC譜圖Figure 2　HPLC photograms of vitamin E in Pearl vitamin E creamA：陰性對照溶液；B：對照品溶液；C：供試品溶液

精密量取2.2.2(1)項下維生素E對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml分別置50 ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得到系列濃度為31.96、63.92、127.84、191.76、255.68 μg/ml的維生素E對照品溶液。精密吸取各濃度的對照品溶液各20 μl，按照2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(c)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=5 347.5c-215.02(r=0.999 9)。結(jié)果表明，維生素E在31.96～255.68 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5精密度實驗(1)日內(nèi)精密度：精密吸取2.2.4項下濃度為63.92 μg/ml的對照品溶液20 μl，按照2.2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，由峰面積計算維生素E的日內(nèi)RSD為0.26%(n=6)。(2)日間精密度：精密吸取2.2.4項下濃度為63.92 μg/ml的對照品溶液20 μl，每天測定1次，連續(xù)測定5 d，記錄峰面積，計算得到日間RSD=0.61%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性實驗按2.2.2(2)項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h各進(jìn)樣1次，記錄峰面積，計算得到RSD=0.49%(n=5)，表明供試品溶液在配制后8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7重現(xiàn)性實驗取同一批號(131008)珍珠維E乳膏5份，按2.2.2(2)項下方法制備5份供試品溶液，以2.2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算得到維生素E的含量為標(biāo)示量的99.0%，RSD=0.40%(n=5)，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.2.8回收率實驗精密稱取9份不含維生素E的空白乳膏各3.0 g，分別加入已知濃度的維生素E對照品適量，制備成濃度相當(dāng)于標(biāo)示量80%、100%、120%(51.14、63.92、76.70 μg/ml)的模擬樣品，按照2.2.2(2)方法制備供試品溶液，測定含量并計算回收率。結(jié)果低、中、高濃度的回收率分別為(100.04±1.57)%、(100.02±0.30)%、(102.92±0.56)%(n=3)。

2.2.9樣品含量測定取3個批號(131008、131104、131105)的珍珠維E乳膏，按2.2.2(2)項下方法制備供試品溶液，以2.2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積。計算得到3個批號的珍珠維E乳膏中的維生素E含量分別為標(biāo)示量的(99.75±1.24)%、(98.83±1.49)%、(101.60±1.81)%(n=3)。

3討論

3.1提取方法的確立在樣品提取方法考察過程中，為了得到良好的破乳效果和符合要求的提取率，本研究分別以流動相和無水乙醇作為維生素B6和維生素E的提取溶劑，在水浴加熱下使其提取完全，再通過冰浴冷卻除去乳膏劑中的基質(zhì)，減少對色譜柱的污染，從而獲得相對理想的提取效果。

3.2檢測方法的選擇本研究在選擇檢測方法時曾參考文獻(xiàn)[1]，按其方法同時測定維生素B6和維生素E的含量，發(fā)現(xiàn)結(jié)果并不理想。維生素B6為水溶性維生素，在水中易溶，在乙醇中微溶[2]；而維生素E是脂溶性維生素，在無水乙醇中易溶，在水中不溶[2]。兩種不同極性的藥品同時用90%乙醇提取，提取不完全，會影響檢測結(jié)果?？疾斓絻煞N主成分的極性相差較大，本研究采用HPLC法分別用不同的溶劑提取、不同的檢測條件測定，得到比較滿意的結(jié)果。

3.3檢測波長的選擇本研究參考文獻(xiàn)[2，3]及檢測器的紫外掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維生素B6在291 nm處有最大吸收，故選取291 nm作為其檢測波長。維生素E在212和285 nm波長處有最大吸收，但在212 nm波長處雜質(zhì)峰的影響較大，故最終選取285 nm作為其檢測波長。

3.4流動相的選擇本研究在測定維生素B6含量時參考文獻(xiàn)[2，3]的流動相條件，發(fā)現(xiàn)各峰分離度較好，但出峰時間較長。最后選用本文的流動相條件，發(fā)現(xiàn)各峰分離度較好，且出峰時間適中。在測定維生素E時參考文獻(xiàn)[4-6]，并對文獻(xiàn)中提到的各種流動相分別進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水(95∶5)作為流動相時分離度較好，出峰時間適中，因此以其作為測定維生素E的流動相。

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[修回日期]2015-04-06

[本文編輯]蘭芬

Determination of vitamin B6and vitamin E contents in Pearl vitamin E cream by HPLC method

CHEN FangJian，LU SongWei，SONG HongJie*，GAO HongBin，QUAN ShanCong,LUO JinQian

(Department of Pharmacy,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

[ABSTRACT]Objective: To establish a HPLC method for the determination of vitamin B6 and vitamin E contents in Pearl vitamin E cream.Methods: The separation of vitamin B(6 )was performed on Kromasil C(18 )column(150 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was composed of methanol-0.04% sodium heptane sulfonic solution(pH adjusted to 3.0 with glacial acetic acid，20∶80) and the detection wavelength was 291 nm.The separation of vitamin E was performed on ACE-121-1546 C(18) column (150 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was composed of methanol-water(95∶5) and the detection wavelength was 285 nm.The flow rate of the mobile phase was 1.0 ml/min and the column temperature was set at room temperature.Results: Vitamin B(6 )was in good linearity within the range of 5.000 5-100.01 μg/ml(r=1.000 0).The average recoveries of low,moderate and high concentrations(80%,100%,120% of the labeled content) were (97.46±1.30)%,(99.00±0.34)% and (98.09±0.56)%(n=3),respectively. Vitamin E was in good linearity within the range of 31.96-255.68 μg/ml (r=0.999 9).The average recoveries of low,moderate and high concentrations(80%,100%,120% of the labeled content) were (100.04±1.57)%,(100.02±0.30)% and (102.92±0.56)%(n=3),respectively.Conclusion: The method is accurate，sensitive，selective and reproducible.It can provide reference for the improvement of the quality standard of Pearl vitamin E cream.

[KEY WORDS]Pearl vitamin E cream;vitamin B6;vitamin E;content determination;chromatography,high performance liquid

[收稿日期]2014-08-04

DOI：10.5428/pcar20150313

[中圖分類號]R972.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-2838(2015)03-0201-04

作者簡介陳方劍(女)，主管藥師.E-mail:ngchenfangjian@126.com;陸松偉(男),主管藥師.E-mail:chinalsw2000@sina.com；兩人為共同第一作者*通信作者(Corresponding author)：宋洪杰，E-mail:h_jsong@126.com

基金項目總后勤部衛(wèi)生部軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(13ZJZ11-3)