劉彬果，任　濤，王　媛(解放軍第二五四醫(yī)院藥劑科，天津 300142)

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·論著·

用HPLC法測定急扁顆粒中綠原酸和連翹苷的含量

劉彬果，任濤，王媛(解放軍第二五四醫(yī)院藥劑科，天津 300142)

[摘要]目的：建立HPLC法測定急扁顆粒中綠原酸和連翹苷含量。方法: Zorbax SB-C(18)色譜柱(150 mm×4．6 mm，5 μm)；以乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)為流動相，流速1.0 ml/min，檢測波長為327 nm測定綠原酸含量；以乙腈-水(25∶75)為流動相，流速1.0 ml/min，檢測波長為278 nm測定連翹苷的含量。結(jié)果: 綠原酸、連翹苷分別在6.24～199.6 μg/ml(r=0.999 9), 7.35～235.2 μg/ml(r=0.999 9)范圍內(nèi)線性良好，平均回收率分別為99.86%和98.30%(n=5)。結(jié)論：該方法快速、簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，結(jié)果可靠，可用于急扁顆粒中綠原酸和連翹苷的含量測定，為全面控制急扁顆粒的質(zhì)量提供可靠方法。

[關(guān)鍵詞]急扁顆粒；綠原酸；連翹苷；含量測定；色譜法，高效液相

[Pharm Care Res，2015，15(3): 193-195]

急扁顆粒為解放軍第二五四醫(yī)院多年的臨床經(jīng)驗方，由金銀花、連翹、桔梗、蒲公英四味中藥組成，具有清熱解毒的功效，臨床適用于急、慢性扁桃腺炎，咽喉腫痛等癥狀。方中金銀花性寒疏散，清熱解毒兼可透散表邪；連翹性寒，清熱解毒且升浮宣散，可清表里，與金銀花相須為用，共為君藥，這兩味藥發(fā)揮藥效的主要成分為綠原酸和連翹苷[1]。關(guān)于中藥制劑中綠原酸和連翹苷的含量測定方法已經(jīng)有相關(guān)報道[1]。急扁顆粒為本院自制制劑，其現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有中藥定性鑒別的方法，沒有含量測定方法。為了更好地控制其質(zhì)量，本研究采用HPLC法，以綠原酸和連翹苷作為指標(biāo)成分進行含量測定。

1儀器和試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀、OpenLAB CDS色譜工作站、Zorbax SB-C18色譜柱(150 mm×4．6 mm，5 μm)色譜柱(美國Agilent公司)；XS十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒集團)。綠原酸對照品(純度 96.6%，批號 110753-201314)、連翹苷對照品(純度 96.8%，批號 110821-201112)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。急扁顆粒由本院制劑室提供(批號13170135、13400137、14040115)。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件(1)綠原酸流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：327 nm，進樣量：10 μl。理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算≥2000。(2)連翹苷流動相：乙腈-水(25∶75)；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：278 nm，進樣量：10 μl。理論塔板數(shù)按連翹苷峰計算≥3000。

2.2對照品溶液的制備(1)綠原酸對照品溶液精密稱取綠原酸對照品4.99 mg，置于25 ml棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，制成綠原酸對照品儲備液(199.6 μg/ml)。(2)連翹苷對照品溶液精密稱取連翹苷對照品5.88 mg，置于25 ml量瓶中，加甲醇制成連翹苷對照品儲備液(235.2 μg/ml)。

2.3供試品溶液的制備(1)綠原酸供試品溶液取急扁顆粒約0.5 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得綠原酸供試品溶液[2,3]。(2)連翹苷供試品溶液取急扁顆粒約4.0 g，余步驟同2.3項(1)。精密量取續(xù)濾液20 ml，蒸干，殘渣用70%乙醇10 ml溶解，加在中性氧化鋁柱(100～120目，6.0 g，內(nèi)徑1 cm)上，用70%乙醇50 ml洗脫，收集洗脫液，濃縮至干。殘渣加適量50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得連翹苷供試品溶液[3,4]。

2.4陰性對照溶液的制備按照處方組成比例，分別制備不含金銀花、蒲公英和連翹藥材的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法分別制備陰性對照溶液。

圖1　綠原酸的HPLC譜圖Figure 1　HPLC photograms of chlorogenic acidA：對照品溶液；B：供試品溶液；C：陰性對照溶液；1：綠原酸

圖2　連翹苷的HPLC譜圖Figure 2　HPLC photograms of forsythinA：對照品溶液；B：供試品溶液；C：陰性對照溶液；1：連翹苷

2.5專屬性實驗分別吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液5 μl，注入液相色譜儀，按2.1項色譜條件分別進行測定，記錄色譜圖(見圖1與圖2)。結(jié)果顯示，在與對照品相同保留時間處無色譜峰，說明本品中的其他成分對測定無干擾。2.6線性關(guān)系的考察精密量取綠原酸對照品儲備液制成濃度為6.24、12.48、24.95、49.9、99.8、199.6 μg/ml的系列對照品溶液；精密稱取連翹苷對照品儲備液制成濃度為7.35、14.7、29.4、58.8、117.6、235.2 μg/ml的溶液。按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以進樣量(c)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,綠原酸：A1=522.3c1-30.34，r=0.999 9(n=6)；連翹苷：A2=6 880.1c2-1.799，r=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明，綠原酸和連翹苷分別在6.24～199.6 μg/ml和7.35～235.2 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7精密度實驗分別精密吸取綠原酸和連翹苷的同一對照品溶液，按2.1項下色譜條件分別測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積的RSD值分別為 0.35%和0.26%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.8穩(wěn)定性實驗分別吸取綠原酸、連翹苷的供試品溶液在室溫下放置不同時間(0、1、4、8、10、12、24 h)，分別測定，其峰面積RSD值分別為 1.32%和1.89%(n=7)，結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9重復(fù)性實驗按2.3項下方法,對同一批(批號13400137)樣品分別平行制備綠原酸、連翹苷樣品溶液各6份,分別測定其含量。結(jié)果綠原酸、連翹苷平均含量分別為3.62 mg/g和0.375 mg/g，RSD值分別為0.86%和1.24%(n=6)，表明分析方法重復(fù)性較好。

2.10加樣回收率實驗取已知含量的同一批號(批號13400137)的樣品5份,研細(xì)，精密稱取，分別精密加入定量的綠原酸和連翹苷對照品溶液,按2.3項下方法制備綠原酸和連翹苷供試品溶液,并按2.1項下色譜條件分別測定，結(jié)果見表1。

表1　綠原酸和連翹苷的加樣回收率實驗結(jié)果

2.11樣品含量測定取批號為13170135、13400137、14040115的樣品，按2.3項下方法分別制備供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，外標(biāo)法定量，計算3個批次的樣品中綠原酸和連翹苷的含量。結(jié)果綠原酸含量分別為34.5、36.3、37.2 mg/g，連翹苷含量分別為0.345、0.367、0.388 mg/g。

3討論

3.1提取方法的選擇在預(yù)實驗中，作者對同一樣品分別采用50%甲醇、70%乙醇為溶劑，以超聲提取、回流提取來制備綠原酸樣品溶液，結(jié)果顯示，采用50%甲醇超聲提取綠原酸較完全，且該方法操作簡單，便于實際操作。在研究連翹苷的提取方法時，根據(jù)藥典方法，采用50%甲醇提取，上中性氧化鋁柱，分離純化效果較好。

3.2檢測波長的選擇采用紫外全波長掃描，綠原酸對照品溶液及供試品溶液在327 nm處有最大吸收。連翹苷對照品溶液和供試品溶液在278 nm處有最大吸收，靈敏度高，所以選擇在327 nm處檢測綠原酸，在278 nm處檢測連翹苷。

3.3流動相的選擇金銀花中的有效成分為綠原酸和異綠原酸等。它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，分離難度大，采用HPLC法測定時，容易出現(xiàn)肩峰。按《中華人民共和國藥典》2010年版方法，分別采用不同比例乙腈-0.4%磷酸進行測定，結(jié)果顯示峰形較好的流動相比例為乙腈-0.4%磷酸(11∶89)，在此比例的流動相條件下，可以有效改善峰形，分離效果明顯。

【參考文獻】

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[修回日期]2015-01-04

[本文編輯]陽凌燕

Content determination of chlorogenic acid and forsythin in Jibian granules by HPLC method

LIU BinGuo,REN Tao,WANG Yuan

(Department of Pharmacy,No.254 Hospital of PLA, Tianjin 300142,China)

[ABSTRACT]Objective: To establish a HPLC method for content determination of chlorogenic acid and forsythin in Jibian granules. Methods: The analysis was performed on Zorbax SB-C(18) column(150 mm×4.6 mm，5 μm).Chlorogenic acid was eluted by acetonitrile-0.4% phosphoric acid (11∶89) as the mobile phase and the flow rate was 1.0 ml/min.The detection wavelength was 327 nm. Forsythin was eluted by acetonitrile-water(25∶75) at a flow rate of 1.0 ml/min,and the detection wavelength was 278 nm.Results: The linear range of chlorogenic acid and forsythin was 6.24-199.6,7.35-235.2 μg/ml(r=0.999 9),and the average recoveries were 99.86% and 98.30% (n=5),respectively. Conclusion:This method is simple，accurate，reproducible and reliable. It is suitable for the content determination of chlorogenic acid and forsythin in Jibian granules and the quality control of Jibian granules as well.

[KEY WORDS]Jibian granules;chlorogenic acid;forsythin;content determination;chromatography,high performance liquid

[收稿日期]2014-07-09

DOI：10.5428/pcar20150311

[中圖分類號]R927.2

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-2838(2015)03-0193-03

作者簡介劉彬果(女)，博士，主管藥師.E-mail：lbg991227@163.com

基金項目總后勤部專項課題(14ZJZ01)