陳進(jìn)會(huì)劉國(guó)慶顏其貴陳珍容*

（1.東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局廣東東莞523072；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院）

犬細(xì)小病毒病毒樣顆粒的研究進(jìn)展

陳進(jìn)會(huì)1劉國(guó)慶1顏其貴2陳珍容2*

（1.東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局廣東東莞523072；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院）

研究人員為防控犬細(xì)小病毒病的傳播研制了多種不同形式的候選疫苗，其中病毒樣顆粒是具有較好應(yīng)用前景的一種候選疫苗，本文就其制備方法及免疫原性的研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

犬細(xì)小病毒；病毒樣顆粒；疫苗

1　前言

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一種具有高度接觸性傳染的烈性傳染病，以劇烈的嘔吐、出血性腸炎和白細(xì)胞顯著減少以及心肌炎為主要特征，發(fā)病率高，傳染性強(qiáng)，死亡率高，是危害我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一［1］。1978年5月，CPV首次在兩只病犬體內(nèi)被檢測(cè)到，其中一只新生幼犬由于心肌炎突然死亡，另一只兩月齡以上幼犬由于嚴(yán)重腹瀉而脫水死亡，同時(shí)該病毒感染了全球不同地區(qū)的野生犬及家養(yǎng)犬［2，3］。1982年，我國(guó)梁士哲等［4］最早報(bào)道了類(lèi)似CPV所致的犬出血性腸炎，1983年徐漢坤等［5］確認(rèn)本病的流行。CPV主要感染犬，其他犬科動(dòng)物，如郊狼、叢林犬、食蟹狐和鬣狗等也可以感染。隨著病毒抗原漂移，病毒已經(jīng)可以感染小熊、貉、大熊貓等動(dòng)物，嚴(yán)重威脅了家犬、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和珍稀野生動(dòng)物的安全［6］。

自1978年以來(lái)，CPV作為一種地方性流行性疾病肆虐全球，雖然疫苗接種能夠在一定程度上保護(hù)幼犬，但野生型的病毒仍舊不能得到控制。預(yù)防CPV病的疫苗最早是使用經(jīng)福爾馬林滅活的貓泛白細(xì)胞減少癥病毒疫苗，也有弱毒疫苗，但免疫效果遠(yuǎn)不如同源疫苗。目前基本上是用同源疫苗，已有部分活疫苗、滅活疫苗商品化，國(guó)內(nèi)主要采用國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的CPV弱毒疫苗進(jìn)行免疫。但弱毒疫苗存在一些缺點(diǎn)：對(duì)一些個(gè)體如免疫缺陷者可能誘發(fā)嚴(yán)重的疾病；可能滯留在環(huán)境中造成環(huán)境污染從而引發(fā)交叉感染；弱毒疫苗穩(wěn)定性較差，可能會(huì)出現(xiàn)毒力反祖現(xiàn)象；保存、運(yùn)輸條件要求較高［7］。隨著黏膜和全身遞送佐劑、脂質(zhì)體、蛋白/多肽包膠、復(fù)合抗原多肽及病毒樣粒子等的逐步應(yīng)用，研發(fā)可部分取代活苗的高效非活性疫苗成為可能［8-10］。其中病毒樣顆粒（Virus-Like Particles，VLPs）疫苗是含有某種病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒(méi)有病毒的核酸（DNA/ RNA），不能自主復(fù)制，其在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，可通過(guò)和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。病毒的衣殼蛋白一般具有天然的自我裝配能力［11］，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)多數(shù)病毒的衣殼蛋白基因在真核表達(dá)系統(tǒng)以及少數(shù)病毒的衣殼蛋白基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中都能夠有效地實(shí)現(xiàn)自我組裝，這為病毒的基礎(chǔ)研究（基因治療、藥物治療等）及疫苗的開(kāi)發(fā)提供了便利條件。

2　CPV的結(jié)構(gòu)蛋白及VLPs的免疫特性

CPV基因組為單股負(fù)鏈DNA，全長(zhǎng)5323nt。CPV基因組包括2個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），5′端ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（668個(gè)氨基酸），即早期轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白（NS1和NS2）；3′端ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白（722個(gè)氨基酸），即晚期轉(zhuǎn)錄的病毒衣殼蛋白（VP1和VP2）。整個(gè)編碼區(qū)基因相互重疊，結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因有各自獨(dú)立的啟動(dòng)子區(qū)域，即晚期啟動(dòng)子和早期啟動(dòng)子。CPV結(jié)構(gòu)含有TATA序列轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和刺激蛋白SP1的結(jié)合位點(diǎn)，這些序列的轉(zhuǎn)錄激活對(duì)于啟動(dòng)子的活性具有重要的作用。CPV基因組另一顯著特點(diǎn)是3′端和5′端各有一個(gè)發(fā)夾樣的回紋結(jié)構(gòu)，一般由120 bp-160 bp堿基組成，但整個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)又被兩個(gè)短的回紋序列中斷，因而末端序列可折成T形或Y形結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)對(duì)病毒的復(fù)制十分重要［12］。

CPV基因主要編碼4種蛋白（VP1，VP2，NS1，NS2），其中VP1和VP2為結(jié)構(gòu)蛋白，NS1和NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白。病毒空衣殼中只含有VP1和VP2兩種蛋白，VP2是構(gòu)成衣殼蛋白的主要成分，位于VP1的C端，VP1蛋白的C端氨基酸和VP2蛋白的N端氨基酸序列相互重疊，且二者終止于同一密碼子。VP1和VP2蛋白在病毒感染過(guò)程中起著極為重要的作用，缺失VP1或VP2蛋白的突變體均喪失了對(duì)宿主細(xì)胞的再感染性。此外，成熟的病毒粒子還含有VP3蛋白，VP3是VP2的裂解物，它只在衣殼裝配和病毒基因組包裝后才出現(xiàn)。研究較多的主要是VP2結(jié)構(gòu)蛋白，CPV的中和抗原位點(diǎn)位于VP2上，VP2蛋白是CPV的免疫原性蛋白，編碼CPV的主要抗原決定簇，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。VP2基因的N端以及該基因上的蛋白轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)區(qū)loop1和loop3是重要的B細(xì)胞抗原表位區(qū)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。VP2基因全長(zhǎng)1755 nt，編碼584個(gè)氨基酸，VP2上的幾個(gè)關(guān)鍵堿基和氨基酸的變化就會(huì)改變抗原特性和宿主范圍。結(jié)構(gòu)和功能研究表明，衣殼上的纖突決定著細(xì)胞向性、宿主范圍和進(jìn)化，這些區(qū)域氨基酸殘基的變化是導(dǎo)致CPV毒株抗原漂移的主要原因［13］。

研究表明，特定情況下，單獨(dú)表達(dá)CPV VP2蛋白可以自組裝成VLPs，且形態(tài)上類(lèi)似于天然病毒。利用CPV VP2蛋白獲得的VLPs，不僅保持了免疫原性，而且能夠模擬CPV自然病毒粒子感染途徑，通過(guò)VP2蛋白與細(xì)胞表面特異受體的結(jié)合實(shí)現(xiàn)CPV VLPs的靶向定位或載運(yùn)。VLPs沒(méi)有感染性，作為免疫原，它可通過(guò)和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，而宿主、病毒和疫苗因素共同決定VLPs產(chǎn)生的機(jī)體防護(hù)水平［14］。

3　CPV-VP2 VLPs的制備方法

對(duì)病毒感染性疾病而言，VLPs是一種理想的疫苗形式。形態(tài)上，VLPs類(lèi)似未成熟的病毒粒子；功能上，具有天然病毒的類(lèi)似嗜性，通過(guò)和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，激發(fā)強(qiáng)有力的特異性體液和細(xì)胞免疫［15］。目前獲準(zhǔn)用于人類(lèi)的VLPs疫苗包括乙型肝炎病毒疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗和戊型肝炎病毒疫苗，已在人群中廣泛應(yīng)用并取得良好效果。同時(shí)，許多病毒的VLPs也被用于基礎(chǔ)性研究，如病毒的組裝機(jī)制及結(jié)構(gòu)研究、病毒與宿主或蛋白與蛋白之間的相互作用［16］。多種表達(dá)系統(tǒng)可用于制備VLPs，包括原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（B/IC）、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因植物。

3.1B/IC系統(tǒng)

B/IC系統(tǒng)是以桿狀病毒為外源基因載體，昆蟲(chóng)細(xì)胞或活體昆蟲(chóng)為受體的真核表達(dá)系統(tǒng)。桿狀病毒能容納大片段的外源基因，關(guān)閉宿主細(xì)胞早期基因轉(zhuǎn)錄而高水平表達(dá)目的蛋白，并能進(jìn)行翻譯后修飾。重組桿狀病毒制備簡(jiǎn)單、快速，能在10-12周內(nèi)完成新病毒VLPs疫苗的生產(chǎn)，特別是一些表面蛋白易于突變的病毒如流感病毒、冠狀病毒等。B/IC系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是同時(shí)表達(dá)大量難以與VLPs分離的桿狀病毒粒子，其具有佐劑活性，如果不去除或滅活，能顯著增加VLPs的免疫原性［17，18］。除此之外，超速離心是純化VLPs的主要方法，難以滿(mǎn)足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。

Chouday等［19］利用蠶蛹幼蟲(chóng)成功表達(dá)了CPV VLPs，經(jīng)接種小鼠后證實(shí)該VLPs具有較強(qiáng)免疫原性。胡桂秋［20］利用B/IC系統(tǒng)表達(dá)了CPV-VP2蛋白，并且該蛋白能在體外自動(dòng)組裝成VLPs。隨后分別在豚鼠和犬兩種動(dòng)物模型中，通過(guò)口服和肌注兩種途徑免疫，對(duì)CPV VLPs的免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為將來(lái)CPV的亞單位疫苗生產(chǎn)提供依據(jù)。王亞君等［21］應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增CPV-VP2基因，將其克隆至Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTc上，命名為pFastBacHTc-VP2，將人工合成的犬瘟熱病毒（CDV）抗原表位基因T.TB克隆至VP2基因的上游，命名為pFastBacHTc-T.TB-VP2，進(jìn)而轉(zhuǎn)入含穿梭載體Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac中，獲得攜帶CDV T.TB細(xì)胞表位和CPV-VP2基因的重組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Bacmid-BacHT-T.TB-VP2，將其轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf-9后獲得融合重組T.TB-VP2蛋白，大小約為70 ku。經(jīng)Western blot分析，結(jié)果顯示：表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性。表達(dá)的重組蛋白在無(wú)佐劑參與的情況下，按確定的免疫程序免疫6-8周齡的BALB/c小鼠，檢測(cè)小鼠的體液免疫學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明：表達(dá)蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗CDV和CPV的特異性中和抗體。這為重組CDV與CPV新型亞單位疫苗的研制奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。馮昊等［22，23］將狂犬病病毒（RV）、CDV、CPV嵌合體VLPs在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，使用該VLPs免疫小鼠，經(jīng)間接免疫熒光、血凝抑制試驗(yàn)及電子顯微鏡檢測(cè)，結(jié)果表明B/IC系統(tǒng)下的CPV嵌合體VLPs成功獲得且具有高免疫原性。

3.2酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

在過(guò)去的20年中，甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為非常成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了數(shù)以千計(jì)的重組蛋白。與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母具有遺傳操作方便、培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)明和適合高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)。賀英等［24］采用PCR方法對(duì)CPV-VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增，將CPV-VP2基因克隆到畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPICZAA中，構(gòu)建真核重組表達(dá)載體pPICZAA-VP2，將該重組質(zhì)粒線性化后，轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）X-33中，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)CPV-VP2，SDS-PAGE和Western-blotting鑒定表達(dá)蛋白。結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增了CPV-VP2基因，構(gòu)建了真核重組表達(dá)載體pPICZAA-VP2，在畢赤酵母菌中表達(dá)出約68000蛋白。經(jīng)Westernblotting鑒定表明，表達(dá)蛋白為目的蛋白VP2。表達(dá)菌株擴(kuò)大表達(dá)體系于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，上清液用70%過(guò)硫酸銨4℃沉淀濃縮，采用His選擇鎳-親和層析柱分離純化獲得重組酵母表達(dá)的帶組氨酸標(biāo)簽的VP2蛋白，表達(dá)量約3mg/L。結(jié)果表明，在畢赤酵母中成功地表達(dá)了CPV-VP2蛋白，且能被CPV-VP2單克隆抗體特異識(shí)別。但該試驗(yàn)未進(jìn)行深入研究，重組畢赤酵母菌所表達(dá)的CPV-VP2蛋白在體外是否能夠自組裝成VLPs有待進(jìn)一步研究。

3.3原核表達(dá)系統(tǒng)

在原核表達(dá)系統(tǒng)中，應(yīng)用較多的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌是第一個(gè)用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、生長(zhǎng)繁殖快、成本低廉，可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點(diǎn)，而且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其他基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)目的蛋白量甚至能超過(guò)細(xì)菌總蛋白量的30%，因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。

利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)CPV VLPs的研究已取得初步進(jìn)展。程言信［25］對(duì)CPV VP2基因分段進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)超聲處理后SDS-PAGE電泳證明了K2和K4片段獲得了良好的可溶性表達(dá)，經(jīng)過(guò)間接ELISA、Western blot鑒定，表明采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的融合蛋白具有與CPV陽(yáng)性抗體特異結(jié)合的良好抗原性。陳勝男［26］成功克隆了CPV VP2基因，將VP2基因成功構(gòu)建到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T中，即pGEX-4T-VP2，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western-Blotting分析，結(jié)果表明，誘導(dǎo)表達(dá)的pGEX-4T-VP2陽(yáng)性菌株可表達(dá)出大小為90 kDa蛋白，該重組蛋白具有反應(yīng)活性。用谷胱甘肽瓊脂糖4B親和層析柱純化目的蛋白，免疫小鼠后，ELISA結(jié)果顯示GST-VP2融合蛋白抗血清效價(jià)隨著免疫次數(shù)的增加而升高，表明得到的重組蛋白具有很好的免疫原性。Xu等［27］利用PCR方法成功擴(kuò)增CPV VP2基因，將VP2基因克隆到pSMK載體中，從而獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pSMK-VP2，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21宿主菌中16℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，用鎳親和層析柱分離、純化CPV VP2蛋白來(lái)去除His標(biāo)簽，然后將純化后的蛋白和SUMO蛋白酶按一定比例混合切除上述兩種標(biāo)簽后，利用VP2結(jié)構(gòu)蛋白在體外自組裝的特性形成VLPs。經(jīng)透射電子顯微鏡鑒定表明，體外環(huán)境自組裝成的CPV VLPs具有與天然病毒相似的顆粒狀結(jié)構(gòu)。接種小鼠后淋巴細(xì)胞分類(lèi)檢測(cè)結(jié)果顯示，該系統(tǒng)下產(chǎn)生的CPV VLPs具有免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

4　結(jié)語(yǔ)

采用基因工程和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的VLPs疫苗是人類(lèi)病毒疫苗史上的一大突破，與傳統(tǒng)的減毒或滅活疫苗相比，高度純化的VLPs疫苗具有組分單一，不含有病毒核酸，良好的安全性和質(zhì)量可控等顯著優(yōu)點(diǎn)，但是研究難度更大，雖然有數(shù)十種VLPs在實(shí)驗(yàn)室中成功制備，卻只有極少數(shù)能夠在疫苗應(yīng)用中取得突破，獲得合適的放大制備工藝、組裝工藝和制劑工藝組合是阻礙其發(fā)展的重要原因［28］。

近30年來(lái)，VLPs大規(guī)模制備與純化技術(shù)已得到快速發(fā)展，迄今已有110余個(gè)VLPs被制備及應(yīng)用評(píng)估。VLPs除了可以直接作為免疫原外，還可作為載體轉(zhuǎn)運(yùn)一些小分子，像肽鏈、DNA分子，也可在粒子表面展示抗原表位。目前多種VLPs已作為疫苗使用，同時(shí)也作為其他小分子的轉(zhuǎn)運(yùn)載體［29］。VLPs的特殊結(jié)構(gòu)決定其能有效的被抗原遞呈細(xì)胞攝取，并刺激機(jī)體產(chǎn)生持久的細(xì)胞免疫和體液免疫。

CPV VLPs類(lèi)似于天然病毒，能提呈多種構(gòu)象表位，誘導(dǎo)有效的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，其疫苗穩(wěn)定性好，不易失活，具有廣闊的發(fā)展前景。培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、成本低廉的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是制備VLPs的首選，雖然大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在制備和組裝大尺度、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的VLPs方面仍然存在諸多問(wèn)題，但是從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)優(yōu)化和分子設(shè)計(jì)入手，同時(shí)進(jìn)行大腸桿菌的外源表達(dá)調(diào)控機(jī)制相關(guān)的功能基因改造，使其更適合VLPs的表達(dá)和組裝。其抗原選擇及制備工藝有待進(jìn)一步優(yōu)化，VLPs疫苗的應(yīng)用策略與免疫保護(hù)效果仍有待在小鼠感染模型驗(yàn)證與改進(jìn)。但無(wú)論如何，基于大腸桿菌的戊型肝炎疫苗和HPV疫苗的成功研制給予人們信心和鼓舞［30，31］，相信最簡(jiǎn)單的大腸桿菌表達(dá)和最接近病毒免疫功能的VLPs技術(shù)相結(jié)合，將帶來(lái)一個(gè)全新的開(kāi)始。

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Progress on the CPV VP2 Virus-Like Particles-Based Vaccine

CHEN Jinhui1，LIU Guoqing1，YAN Qigui2，CHEN Zhenrong2*
（1.Dongguan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dongguan，Guangdong，523072；2.Veterinary Medicine College of Sichuan Agricultural University）

Several novel vaccines have been developed to prevent virus spreading，and the virus-like particles（VLPs）of CPV VP2 was one of most prom ising vaccine candidate.We here w ill give a brief review on the preparation and immunogenicity of VLPs-based CPV vaccine.

Canine Parvovirus；Virus-Like Particles；Vaccine

S852.65

E-mail：chenjinhui@dg.gdciq.gov.cn；通訊作者E-mail：czr777@126.com

教育部《長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃》創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（IRTO848）

2016-02-23