聶　甜，蔣文明，彭素娟，張旻昱，楊　琳，李仕能，胡　妮

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長(zhǎng)沙　410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙　410005；

3.湖南省人民醫(yī)院，長(zhǎng)沙　410005；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙　410007)

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大鼠原發(fā)免疫性血小板減少性紫癜熱盛模型的建立與評(píng)價(jià)

聶甜1，蔣文明1，彭素娟2，張旻昱3，楊琳4，李仕能1，胡妮1

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙410005；

3.湖南省人民醫(yī)院，長(zhǎng)沙410005；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙410007)

【摘要】目的建立同時(shí)符合中醫(yī)“熱盛證”和原發(fā)免疫性血小板減少性紫癜外周血血小板減少的大鼠模型。方法采用SD大鼠背部多點(diǎn)注射20%干酵母菌懸液和腹腔注射1∶4稀釋的兔抗SD大鼠血小板血清(APS)建立原發(fā)免疫性血小板減少性紫癜熱盛大鼠模型。并觀察受試大鼠的中醫(yī)證侯特點(diǎn)、血象、骨髓象及丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞5-羥色胺(5-HT)的水平。結(jié)果模型組大鼠注射后2～6 h體溫和日飲水量顯著上升，造模第4天出現(xiàn)足趾紫癜和造模第30天出現(xiàn)腸道黏膜出血(P < 0.05)；外周血象中血小板數(shù)顯著降低，骨髓象巨核細(xì)胞數(shù)顯著減少(P < 0.05)；大腦體溫調(diào)節(jié)中樞5-HT的水平顯著增高(P < 0.05)。結(jié)論原發(fā)免疫性血小板減少性紫癜熱盛大鼠病證結(jié)合模型基本體現(xiàn)了“熱盛”所致原發(fā)免疫性血小板減少性紫癜大鼠發(fā)生紫癜的病理特點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】原發(fā)免疫性血小板減少性紫癜；熱盛證；大鼠模型

原發(fā)免疫性血小板減少性紫癜(immune thrombocytopenia，ITP)是一種血小板免疫性破壞的常見(jiàn)出血性疾病[1]。第七屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合血液病學(xué)術(shù)會(huì)議將ITP的中醫(yī)病名定為“紫癜病”。熱盛證是ITP患者常見(jiàn)的中醫(yī)證型，熱灼脈絡(luò)、迫血妄行是ITP熱盛證的基本病機(jī)[2-3]。對(duì)糖皮質(zhì)激素耐藥、難以耐受免疫抑制劑毒副作用、病程長(zhǎng)的ITP患者采用具有清熱作用的復(fù)方治療，其結(jié)果顯示了較好的臨床療效[4]。但是，目前對(duì)這類復(fù)方干預(yù)ITP的效應(yīng)機(jī)制研究仍缺乏符合中醫(yī)“病證”特點(diǎn)的ITP動(dòng)物模型，這可能進(jìn)一步限制ITP中藥新藥開(kāi)發(fā)和中藥復(fù)方的藥效學(xué)研究。為此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究和文獻(xiàn)調(diào)查的基礎(chǔ)上[5]，采用20%干酵母菌懸液聯(lián)合抗血小板血清(APS)注射SD大鼠法建立原發(fā)免疫性血小板減少性紫癜熱盛大鼠模型，并評(píng)價(jià)該模型的基本病理特點(diǎn)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，體重160～200 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(湘)2013-0004】。清潔級(jí)新西蘭雄性白兔5只，體重1.7～2 kg，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司【SCXK(湘)2009-0012】。實(shí)驗(yàn)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，使用許可證號(hào)【SYXK(湘)2013-0005】。

1.1.2儀器TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀醫(yī)療設(shè)備廠。XT-4000i全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，日本希森美康公司。Leica dm 2500普通顯微鏡，德國(guó)徠卡公司。電子體溫計(jì)，溫州友尚醫(yī)療科技有限公司。

1.1.3試劑 弗氏完全佐劑，購(gòu)自武漢博士德生物公司(生產(chǎn)批號(hào)：bstzje10bwq)。不完全弗氏佐劑，購(gòu)自武漢博士德生物公司(生產(chǎn)批號(hào)：bstbzje10bwq)。5-羥色胺免疫檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：H9523)。0.01 mol/L pH7.3 磷酸鹽緩沖液(PBS)，購(gòu)自武漢博士德生物公司(生產(chǎn)批號(hào)：09D16B30)。干酵母菌:安琪高活性干酵母，購(gòu)自安琪酵母股份有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：1124686937)。瑞氏-姬姆薩染液，購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：413123)。多聚甲醛，購(gòu)自湖北奧生新材料科技有效公司(生產(chǎn)批號(hào)：XK13-201-00399)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1兔抗SD大鼠血小板血清(APS)的制備 腹主動(dòng)脈取血獲取SD大鼠外周血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，1500 r/min離心15 min獲取富血小板血漿。3200 r/min，4℃離心10 min，去上清，獲得血小板。用0.01 mol/L pH7.3的PBS洗滌、離心3次并混懸血小板至109/L。取血小板懸液與10 mL弗氏完全佐劑等量混勻形成乳白色黏稠乳劑，備用。向每只新西蘭兔兩后肢足墊及背部多點(diǎn)注射致敏。首次注射后第1、2、3、4周，按上述方法再次獲得血小板懸液，取血小板懸液與10 mL不完全弗氏佐劑等量混合。向每只新西蘭兔兩后肢足墊及背部多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫。末次加強(qiáng)免疫后第3天心臟采集白兔外周血，3000 r/min離心10 min，獲取富含兔抗SD大鼠血小板血清，貯存在-80℃冰箱中備用(臨用時(shí)取出，56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體)。

1.2.220%干酵母菌懸液的配制 稱取10 g干酵母菌，將其溶于40 mL蒸餾水，玻璃棒混勻(臨用臨配)。

1.2.3分組與處理 將40只SD大鼠隨機(jī)分成模型組、干酵母菌組、APS組和正常大鼠組，每組各10只。模型組采用干酵母菌聯(lián)合APS注射法造模：每天均背部多點(diǎn)注射20%干酵母菌懸液(2 mL/200g)1次，連續(xù)30 d。第1天、第2天、第3天腹腔注射1∶4稀釋的兔抗SD大鼠血小板血清(0.7 mL/200g)1 次，后每隔一天注射一次兔抗SD大鼠血小板血清。干酵母菌組：每天均背部多點(diǎn)注射20%干酵母菌懸液(2 mL/200g)1次，連續(xù)30 d。APS組：第1天、第2天、第3天腹腔注射1∶4稀釋的兔抗SD大鼠血小板血清(0.7 mL/200g)1 次，后每隔一天注射一次兔抗SD大鼠血小板血清。正常大鼠組：每天均背部多點(diǎn)注射生理鹽水(2 mL/200g)1次，連續(xù)30 d。第1天、第2天、第3天腹腔注射生理鹽水(0.7 mL/200g)1 次，后每隔一天注射一次生理鹽水。

1.2.4標(biāo)本采集與制備 各組大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(1 mL/100g)，腹主動(dòng)脈采血2 mL，EDTA抗凝。組織剪分離股骨，剪其一端，挑出骨髓置于載玻片上，涂片后待干，做瑞士-姬姆薩染色。斷頸法獲取大腦，置于4%多聚甲醛固定液中。

1.2.5指標(biāo)檢測(cè)

1.2.5.1外周血血小板數(shù)的檢測(cè)：XT-4000i全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)血小板數(shù)。

1.2.5.2骨髓巨核細(xì)胞數(shù)的檢測(cè)：顯微鏡低倍鏡下(10×10)計(jì)數(shù)巨核細(xì)胞數(shù)。

1.2.5.3大腦體溫調(diào)節(jié)中樞5-羥色胺的檢測(cè)：組織切片脫蠟至水，3%H2O2室溫滅活10 min，PBS洗3次?？乖迯?fù)，PBS洗3次。滴加正常山羊血清封閉，室溫20 min，甩去多余液體。滴加I抗，室溫1 h。PBS洗3次，滴加二抗室溫1 h。PBS洗4次，5 min，DAB顯色。蒸餾水洗10 min，蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化。脫水、透明、封片、鏡檢。隨機(jī)挑選5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用“±s”表示，所有資料進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)；不符合正態(tài)性和方差齊性者用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較用Nemenyi法檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有顯著意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠中醫(yī)證侯出現(xiàn)情況的比較

2.1.1發(fā)熱與體溫變化情況

采用電子體溫計(jì)，檢測(cè)各組大鼠體溫(直腸溫度)變化。處理期間模型組和干酵母菌組的大鼠出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，在注射20%干酵母菌懸液后2 h體溫開(kāi)始上升，注射后6 h體溫達(dá)高峰(圖2)。而APS組和正常大鼠組的大鼠在此時(shí)間點(diǎn)體溫?zé)o顯著變化，注射20 h后各組大鼠體溫恢復(fù)正常(圖1)。與APS組和正常大鼠組相比較，模型組和干酵母菌組大鼠體溫升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

注：模型組與APS組相比，﹟P < 0.05；與正常大鼠組相比，﹡P < 0.05。干酵母菌組與APS組相比，※P < 0.05；與正常大鼠組相比，★P < 0.05。圖1　各組大鼠體溫(直腸溫度)變化Note：Compared with model group and APS group，﹟P < 0.05；Compared with normal rat group，﹡P < 0.05.Compared with dry yeast group and APS group，※P < 0.05；Compared with normal rat group，★P < 0.05.Fig.1　Changes in body temperature(rectal temperature)of rat

圖2　注射后2 h和 6 h各組大鼠體溫(直腸溫度)情況Fig.2　Temperature(rectal temperature)conditions of rat in 2 h and 6 h after injection

2.1.2口渴與飲水量的變化情況

處理期間模型組和干酵母菌組大鼠出現(xiàn)了口渴癥狀，APS組和正常大鼠組大鼠未出現(xiàn)口渴癥狀。與APS組和正常大鼠組大鼠相比，飲水量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，圖3)。

注：模型組與APS組相比，◆P < 0.05；與正常大鼠組相比，▲P < 0.05。干酵母菌組與APS組相比，●P < 0.05；與正常大鼠組相比，★P < 0.05。圖3　各組大鼠日飲水量情況Note：Compared with model group and APS group，◆P < 0.05；Compared with normal rat group，▲P < 0.05.Compared with dry yeast group and APS group，●P < 0.05；Compared with normal rat group，★P < 0.05.Fig.3　Daily drinking water quantity of rats

2.1.3便干癥狀的比較

處理期間模型組和干酵母菌組大鼠出現(xiàn)大便硬結(jié)[6](糞便表面干燥，質(zhì)地堅(jiān)硬)，而APS組和正常大鼠組大鼠大便相對(duì)濕潤(rùn)(糞便表面水分多，濕潤(rùn)，質(zhì)地松軟)。模型組、干酵母菌組與APS組、正常大鼠組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，圖4)。

圖4　各組大鼠大便情況Fig.4　Shit situation of rat

2.1.4紫癜出現(xiàn)及消退情況

在注射APS的第4天，模型組和APS組的大鼠足趾出現(xiàn)了紫癜，而干酵母菌組和正常大鼠組的大鼠未見(jiàn)紫癜。與干酵母菌組和正常大鼠組相比，模型組和APS組的大鼠紫癜癥狀顯著(P< 0.05，彩插6圖5)。處理第14天模型組和APS組各有5只大鼠紫癜開(kāi)始消退。處理第19天APS組大鼠紫癜消失，模型組仍有6只大鼠存在紫癜，但顏色較前變淺；模型組與APS組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，圖6)。

2.1.5腸道出血情況

造模30 d后處死各組大鼠，模型組有4只大鼠發(fā)生腸道出血，其余各組未見(jiàn)腸道出血。模型組與其它三組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05，彩插6圖7)。

2.1.6耳廓深紅與舌色癥狀的變化比較

處理期間四組大鼠的耳廓和舌質(zhì)未見(jiàn)深紅表現(xiàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05，圖8)。

2.2各組大鼠外周血血小板數(shù)的比較

與正常大鼠組相比，模型組大鼠和APS組大鼠造模后外周血血小板顯著下降(P< 0.05)。但干酵母菌組大鼠沒(méi)有出現(xiàn)血小板數(shù)下降，與正常大鼠組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05，圖9)。

2.3各組大鼠骨髓巨核細(xì)胞數(shù)的比較

取各組大鼠股骨骨髓液涂片，做瑞士-姬姆薩染色，顯微鏡低倍鏡下計(jì)數(shù)全片巨核細(xì)胞數(shù)量。模型組、干酵母菌組、APS組、正常大鼠組巨核細(xì)胞數(shù)分別為：202.40±97.29、625.70±180.74、234.80±114.54、1235.60±177.16。結(jié)果提示：模型組和APS組大鼠骨髓組織中巨核細(xì)胞數(shù)顯著低于干酵母菌組和正常大鼠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，彩插7圖10)。

2.4各組大鼠大腦體溫調(diào)節(jié)中樞5-羥色胺水平的比較

5-羥色胺(5-HT)是體溫調(diào)節(jié)中樞重要的發(fā)熱介質(zhì)。免疫組化結(jié)果顯示，模型組和干酵母菌組大鼠丘腦組織中5-羥色胺含量顯著高于APS組和正常大鼠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，彩插7圖11)。模型組大鼠腦組織5-HT的光密度值為0.72±0.19，干酵母菌組為0.70±0.29，APS組為0.58±0.14，正常大鼠組為0.58±0.14。模型組和干酵母菌組5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物平均光密度值高于APS組和正常大鼠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，圖12)。

圖6　各組大鼠紫癜變化情況Fig.6　Changes of rat purpura

圖8　各組大鼠耳廓及舌質(zhì)深紅情況Fig.8　Auricle and tongue crimson condition of rat

注：模型組與正常大鼠組相比，★P < 0.05；干酵母菌組與與正常大鼠組相比，▲P > 0.05；APS組與正常大鼠組相比，△P < 0.05。圖9　各處理因素對(duì)SD大鼠外周血血小板數(shù)的影響Note：Compared with model group and normal rat group，★P < 0.05；Compared with dry yeast group and normal rat group，▲P > 0.05；Compared with APS group and normal rat group，△P < 0.05.Fig.9　Effects of various factors on peripheral blood platelet count of SD rat

注：模型組與APS組相比，◆P < 0.05；與正常大鼠組相比，▲P < 0.05；干酵母菌組與APS組相比，●P < 0.05；與正常大鼠組相比，★P < 0.05。圖12　各組大鼠腦組織5-HT光密度值比較Note：Compared with model group and APS group，◆P < 0.05；Compared with normal rat group，▲P < 0.05；Compared with dry yeast group and APS group，●P < 0.05；Compared with normal rat group，★P < 0.05.Fig.12　5-HT optical density value comparison in brain tissue of rat

3討論

建立一種比較理想的大鼠原發(fā)免疫性血小板減少性紫癜熱盛模型(病證結(jié)合模型)，對(duì)于進(jìn)一步探索ITP中醫(yī)證型的病理本質(zhì)，闡述中藥復(fù)方干預(yù)ITP的作用機(jī)制，揭示祖國(guó)中醫(yī)學(xué)辨證施治的科學(xué)性等方面具有重要意義。目前，病證結(jié)合模型研究仍是中醫(yī)學(xué)科研的瓶頸。其原因?yàn)槟承┎∽C結(jié)合模型很難同時(shí)兼顧疾病的病理特點(diǎn)與中醫(yī)證侯特征。因此，大鼠ITP熱盛模型(病證結(jié)合模型)能否建立主要取決于造模方法能否同時(shí)兼顧上述兩點(diǎn)，主要表現(xiàn)為以下兩方面：(1)選用的造模方法能否復(fù)制ITP的病理特點(diǎn)；(2)該方法能否同時(shí)使ITP大鼠表現(xiàn)典型的中醫(yī)熱盛證侯，如發(fā)熱、口渴、紫癜等；而這一點(diǎn)顯得尤為重要，因?yàn)樯鲜鲎C候是中醫(yī)學(xué)判定證型的辨證要素。

被動(dòng)免疫法造模是ITP動(dòng)物造模的主要方法。1951年，William J. Harrington[7]輸注了500 mL ITP患者血液，誘發(fā)了嚴(yán)重的血小板減少癥，3 d后出現(xiàn)皮膚出血。此后，研究者常在被動(dòng)免疫狀態(tài)下，將抗血小板血清(APS)或鼠抗 GPIIb/IIIa單克隆抗體輸入動(dòng)物體內(nèi)造成血小板破壞，形成紫癜。Domínguez V等[8]用兔抗BALB/C小鼠血小板血清免疫BALB/C小鼠，小鼠皮膚出現(xiàn)紫癜，成功獲得ITP小鼠模型。Song S等[9]通過(guò)向未經(jīng)過(guò)IVIG預(yù)處理SCID小鼠腹腔注射抗GPIIb單克隆抗體(MWReg30)和抗GPIIIa單克隆抗體(2C9.G2)誘導(dǎo)產(chǎn)生了ITP小鼠模型，而經(jīng)IVIG預(yù)處理的小鼠未出現(xiàn)ITP相關(guān)癥狀，說(shuō)明IVIG可保護(hù)SCID小鼠血小板免受抗血小板單克隆抗體的破壞。被動(dòng)免疫法造模優(yōu)點(diǎn)在于反復(fù)輸入抗血小板抗體，容易造成體內(nèi)血小板迅速破壞，誘發(fā)出血；且不易造成其它血細(xì)胞發(fā)生破壞和組織損傷。兩者優(yōu)點(diǎn)區(qū)別在于：APS法造模有明確的血小板抗體，造模后出血癥狀明顯，而單克隆抗體造模法主要用于IVIG等藥物抗ITP機(jī)制研究。中醫(yī)證侯是判斷證型的關(guān)鍵因素，紫癜(出血)對(duì)于判定ITP大鼠模型是否呈現(xiàn)熱盛迫血具有重要意義。因此，基于APS造模法易出現(xiàn)紫癜的優(yōu)點(diǎn)，本課題組未采用特定的單克隆抗體，而是沿用APS法造模，希望出血癥狀明顯。

熱邪是中醫(yī)臨床出血常見(jiàn)的病因之一。《諸病源候論·熱病衄候》曰：“邪熱與血?dú)獠?，故衄也”?！毒霸廊珪ぱC》曰：“出血者多由于火，火盛則破血妄行”。因此，良好的致熱源是ITP大鼠呈現(xiàn)熱盛證的關(guān)鍵。左澤平等[10]建立了不同濃度的大鼠干酵母、2，4-二硝基酚、脂多糖、細(xì)菌內(nèi)毒素模型，研究發(fā)現(xiàn)20%干酵母菌懸液大鼠模型升溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)熱穩(wěn)定。故本課題組采用20%干酵母菌懸液聯(lián)合APS法造模建立大鼠ITP熱盛病證結(jié)合模型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SD大鼠經(jīng)皮下注射20%干酵母菌懸液和腹腔注射1：4稀釋的APS后，模型組大鼠出現(xiàn)了發(fā)熱、口渴、便干、足趾紫癜證侯，表現(xiàn)為熱盛迫血妄行。同時(shí)，模型組大鼠外周血血小板數(shù)和骨髓巨核細(xì)胞數(shù)降低，表現(xiàn)為急性ITP血象和骨髓象。其潛在的機(jī)制為酵母致大鼠丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞發(fā)熱介質(zhì)5-HT 含量上升，引起SD大鼠體溫上升(圖11和圖12)；被動(dòng)免疫狀態(tài)下，APS能導(dǎo)致SD大鼠外周血血小板數(shù)降低，引起出血。這提示該方法可以誘導(dǎo)ITP大鼠出現(xiàn)熱盛證。僅皮下注射干酵母菌懸液或腹腔注射APS均未表現(xiàn)出熱盛相關(guān)證侯。郜新蓮等[11]采用腹腔注射細(xì)菌內(nèi)毒素聯(lián)合皮下注射酵母菌制作了大鼠血熱出血模型，機(jī)制主要是由于劇烈炎癥引起的發(fā)熱兼出血。但是，該血熱出血模型并沒(méi)有引起大鼠外周血血小板的減低。

身熱煩渴，便干，吐血，衄血是熱迫血行的特征證侯[12]。在注射APS的第4天，模型組和APS組的大鼠足趾均出現(xiàn)了紫癜,而另外兩組未出現(xiàn)紫癜(圖5)。研究表明[13]，兔抗大鼠血小板血清(APS)與大鼠血小板結(jié)合后被大鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬破壞，從而引起大鼠外周血血小板數(shù)降低，誘發(fā)紫癜。模型組和干酵母菌組大鼠注射20%干酵母菌懸液后出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，同時(shí)有口渴和便干癥狀。這是因?yàn)楦山湍妇欠N常用的外源性致熱源，其皮下注射后能引起丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞發(fā)熱介質(zhì)5-HT含量上升，誘發(fā)體溫上升[14](圖11)。Chander V等[15]研究顯示酵母致大鼠發(fā)熱與體溫調(diào)節(jié)中樞發(fā)熱介質(zhì)5-HT 含量變化有關(guān), 且下丘腦組織中5-HT含量隨體溫的改變而改變。四組大鼠均未見(jiàn)舌紅。而舌質(zhì)的改變受血供的多少(舌血供豐富，含舌下動(dòng)脈和舌深動(dòng)脈多條分支)、微血管的收縮與擴(kuò)張影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)注射后6 h模型組大鼠呈現(xiàn)中度發(fā)熱，干酵母菌組大鼠呈現(xiàn)輕度發(fā)熱。這種發(fā)熱的程度可能未引起舌動(dòng)脈的明顯擴(kuò)張和血供增加，因此，各組大鼠未見(jiàn)舌質(zhì)改變。

被動(dòng)免疫狀態(tài)下，抗血小板抗體引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血血小板數(shù)降低是制作急性ITP動(dòng)物模型的常用方法。本研究發(fā)現(xiàn)APS注射后SD大鼠血小板數(shù)和骨髓巨核細(xì)胞數(shù)降低。原因?yàn)檠“搴凸撬璩墒飚a(chǎn)血小板型巨核細(xì)胞表面均表達(dá)GPIIb/IIIa，抗血小板抗體與其結(jié)合后，可誘導(dǎo)血小板被大鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞損害和巨核細(xì)胞分化障礙[16]。雖然本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射20%干酵母菌懸液和腹腔注射APS法制作了ITP血分熱盛證模型，初步闡述了該方法的制作機(jī)制。但仍需進(jìn)一步探討該模型“熱性病機(jī)”的免疫病理實(shí)質(zhì)。

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研究報(bào)告

Establishment and evaluation of heat sheng model of rat

primary immune thrombocytopenic purpura

NIE Tian1，JIANG Wen-ming1，PENG Su-juan2，ZHANG Min-yu3，YANG Lin4，LI Shi-neng1，HU Ni1

(1.College of Integrated Chinese and Western Medicine, Hunan University of TCM，Changsha 410208，China；

2.The Second Affiliated Hospital，Hunan University of TCM，Changsha 410005，China；

3.Hunan People，Hospital，Changsha 410005，China；4.The First Affiliated Hospital,

Hunan University of TCM，Changsha 410007，China)

【Abstract】ObjectiveTo establish a rat model at the same time in accordance with the “hot sheng syndrome” of traditional Chinese medicine and primary immune thrombocytopenic purpura of peripheral blood platelet reduction. Methods Using back multi-point injection of 20% dry yeast suspension on SD rats and 1∶4 dilution of rabbit anti SD rats platelet serum (APS) by intraperitoneal injection to establish a primary immune thrombocytopenic purpura “heat sheng”rat model. And observing rats of TCM syndrome characteristics, hemogram, myelogram and serotonin (5-HT) level of the temperature regulating center in thalamus. ResultsAfter injection of 2 h ～ 6 h temperature and daily water of the model group rats increased significantly,toe purper showed in fourth day of modeling and intestinal mucosal bleeding in thirty day of modeling(P < 0.05);Platelet count in peripheral blood decreased significantly, bone marrow megakaryocyte number reduced significantly((P < 0.05);5-HT level of the temperature regulating center of brain increased significantly((P < 0.05). ConclusionsThe study of the primary immune thrombocytopenic purpura heat sheng rat model of combination of disease and syndrome reflected basically the pathological characteristics of purpura caused by “heat sheng”in primary immune thrombocytopenic purpura rat mode.

【Key words】Primary immune thrombocytopenic purpura；Heat sheng；Heat syndrome；Rat model

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.004

【中圖分類號(hào)】R332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 05-0013-07

[通訊作者]蔣文明(1962-)，男，教授，研究方向：難治性血液病的中醫(yī)藥防治。Email:2839040380@qq.com。

[作者簡(jiǎn)介]聶甜(1983-)，男，博士生，專業(yè)：中西醫(yī)結(jié)合血液病學(xué)。Email：568098977@qq.com。

[基金項(xiàng)目]湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2013B331)。