張春紅，衛(wèi)云麗，吳文龍，馬　兵，李維林

(1. 中國(guó)科學(xué)院江蘇省植物研究所，江蘇　南京　210014；2. 南京中植農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司，江蘇　南京　211225)

黑莓雜交優(yōu)株的SSR指紋圖譜鑒定

張春紅1，衛(wèi)云麗1，吳文龍1，馬兵2，李維林1*

(1. 中國(guó)科學(xué)院江蘇省植物研究所，江蘇南京210014；2. 南京中植農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司，江蘇南京211225)

摘要：運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)來(lái)自相同或不同親本的6個(gè)黑莓潛力雜交組合優(yōu)株進(jìn)行了分子鑒定，確定指紋圖譜。結(jié)果表明，78對(duì)SSR引物中共有25對(duì)在4個(gè)親本品種中具有多態(tài)性。將各自在不同雜交組合親本中具有多態(tài)的引物用于優(yōu)株鑒別，發(fā)現(xiàn)Kiowa×Arapaho組合中的3個(gè)優(yōu)株有12對(duì)親本間呈多態(tài)的引物可以鑒別，優(yōu)株10-2n-1有6對(duì)擴(kuò)增為雜合帶型，10-2n-2和10-2n-5均有5對(duì)，其余則偏父本或母本一方，且有5對(duì)引物可以區(qū)分3個(gè)優(yōu)株；來(lái)自Chester×Kiowa組合的優(yōu)株10-5n-2在18對(duì)多態(tài)引物中多擴(kuò)增為雙親重組類(lèi)型，推測(cè)其性狀可能多介于雙親之間；來(lái)自Hull×Kiowa組合的優(yōu)株10-6n-1-1和10-6n-1在6對(duì)多態(tài)引物擴(kuò)增結(jié)果中，10-6n-1-1多繼承了父本的帶型，而10-6n-1擴(kuò)增多顯示為雙親雜合帶型。鑒定結(jié)果為育種中相同親本雜交組合黑莓優(yōu)株區(qū)分提供了依據(jù)，也一定程度上揭示了黑莓雜交重組中的復(fù)雜性和不確定性。

關(guān)鍵詞：黑莓；雜交優(yōu)株；SSR標(biāo)記；DNA指紋圖譜

文章編號(hào)：1001-7380(2015)05-0001-05

收稿日期：2015-09-18;修回日期：2015-09-21

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目“早熟、無(wú)刺、小籽黑莓優(yōu)良品種選育”(CX[14]2021)；中植農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新基金“優(yōu)質(zhì)無(wú)刺早熟黑莓新品系篩選與展示”(201401)

作者簡(jiǎn)介：張春紅(1979- )，女，山東菏澤人，副研究員，博士，從事黑莓生物技術(shù)育種工作。E-mail：chzhang0714@163.com。

通信作者：*李維林(1966-)，男，陜西漢中人，研究員，主要從事懸鉤子屬植物利用研究。

中圖分類(lèi)號(hào)：S663.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi:10.3969/j.issn.1001-7380.2015.05.001

DNA fingerprinting identification of blackberry hybrid

strains with SSR molecular markers

ZHANG Chun-hong1, WEI Yun-li1, WU Wen-long1, MA Bing2,LI Wei-lin1*

(1.Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China;

2. Nanjing Zhongzhi Agricultural Science and Technology Development Co. Ltd., Nanjing 211225,China)

Abstract：Using SSR molecular markers, DNA fingerprints of six potential hybrid strains from the same or different hybrid parents were identified. The results showed that 25 of the 78 pairs of SSR primers had polymorphism in the four parent varieties. After the polymorphic primers for parents of different hybrid combinations were further used for superior strain identification, for the hybrid combination of Kiowa×Arapaho, three superior strains could be identified by 12 SSR pairs which performed polymorphic between parents. The superior plant 10-2n-1 showed heterozygous bands by six pairs’ amplification while 10-2n-2 and 10-2n-5 both had five pairs. The bands for the rest primers were all same to the father or mother and five pairs of primers could discriminate three superior strains. There was one superior plant 10-5n-2 selected from the hybrid combination of Chester×Kiowa, which could be identified from the parents by combination of 18 pairs of polymorphic primers. Thus it was speculated that the traits of 10-5n-2 might be between the parents. Superior plants 10-6n-1-1 and 10-6n-1 were from the same hybrid combination Hull×Kiowa. By amplification of six pairs of SSR polymorphic primers, 10-6n-1-1 mainly inherited the male parent and 10-6n-1 tended to display parents’ heterozygous bands. The identification of different strains of the same hybrid combination not only provided the basis for distinguishment between superior plants in future’s blackberry breeding but also partly revealed the complexity and uncertainty in blackberry hybrid breeding.

Key words：Blackberry (Rubus sp.); Superior hybrid strain; SSR marker; DNA fingerprint

黑莓(Blackberry)是薔薇科懸鉤子屬(Rubus)的一種特色漿果類(lèi)果樹(shù)，因其果實(shí)富含花青素和維生素E而成為極具發(fā)展?jié)摿Φ奶胤N經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種[1]。黑莓自1986年由江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所引進(jìn)以來(lái)，為江蘇低山丘陵地區(qū)的開(kāi)發(fā)和農(nóng)民增收做出了貢獻(xiàn)[2]，但由于適生品種單一、企業(yè)配套滯后及工業(yè)污染等，使其產(chǎn)業(yè)發(fā)展也面臨困境[3]。目前國(guó)外對(duì)適于生產(chǎn)的優(yōu)良新品種的保護(hù)尤為重視，國(guó)內(nèi)很難引進(jìn)理想的品種類(lèi)型，培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的黑莓新品種迫在眉睫。

國(guó)內(nèi)自開(kāi)展黑莓引種以來(lái)，不僅進(jìn)行了適應(yīng)性栽培和鮮果的開(kāi)發(fā)利用[4]，也開(kāi)展了一系列雜交組合配制[5]和品種選育[6]研究，但由于懸鉤子植物遺傳背景較為復(fù)雜及不同倍性種質(zhì)的親和性較低致使常規(guī)育種工作進(jìn)展較慢。SSR(Simple Sequence Repeats)又稱(chēng)簡(jiǎn)單序列重復(fù)，是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種新型DNA標(biāo)記，具有可靠性強(qiáng)、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)，在不同樹(shù)種上被廣泛用于優(yōu)株輔助選擇[7]、親本確認(rèn)[8]及資源比較鑒定[9]。在品種鑒定方面，本課題組利用已報(bào)道的部分SSR標(biāo)記對(duì)黑莓雜交品種寧植2號(hào)進(jìn)行了親本確認(rèn)[10]。

在江蘇現(xiàn)有表現(xiàn)較好的黑莓引進(jìn)品種中，Kiowa具有生長(zhǎng)量最大、單果最重和產(chǎn)量最高的特性，但枝蔓有刺[11-12]，Arapaho最早熟但產(chǎn)量很低，Chester高產(chǎn)、果實(shí)硬度大但因晚熟而易遭遇高溫梅雨天氣，Hull高產(chǎn)但果實(shí)較小[12]。為適應(yīng)當(dāng)前黑莓發(fā)展需要，理想的育種目標(biāo)應(yīng)集無(wú)刺、早熟和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)為一體。在通過(guò)多種雜交組合配制、初步選出表現(xiàn)性狀較好的優(yōu)株基礎(chǔ)上，本研究利用懸鉤子SSR標(biāo)記引物進(jìn)一步檢驗(yàn)各優(yōu)株在遺傳特性上的表現(xiàn)，以及對(duì)來(lái)自相似或相同親本的不同早熟無(wú)刺優(yōu)株加以區(qū)別，以期為確定優(yōu)株親本來(lái)源及為育成品種指紋圖譜鑒定提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1　研究材料

黑莓試驗(yàn)材料取自江蘇南京溧水白馬農(nóng)業(yè)科技園區(qū)，為4個(gè)親本品種(Hull，Chester，Arapaho 和Kiowa，來(lái)源如圖1)及6個(gè)雜交優(yōu)株(10-2n-1，10-2n-2，10-2n-5， 10-5n-2， 10-6n-1和10-6n-1-1)。取黑莓幼嫩葉片，置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　DNA提取

各材料基因組DNA提取采用CTAB法，具體過(guò)程參照文獻(xiàn)[13]。

1.3　SSR引物合成

所用的78對(duì)SSR引物，4對(duì)來(lái)自紅樹(shù)莓品種‘Meeker’(Rubusidaeus)，8對(duì)來(lái)自黑莓雜交品種‘Marion’[14]，其余66對(duì)來(lái)自紅樹(shù)莓品種‘Glen Moy’(RubusidaeusL. subspidaeus)[15]。引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.4　SSR-PCR反應(yīng)及電泳分析

SSR-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[10]。所用Taq酶和Marker產(chǎn)品分別購(gòu)自百泰克生物(北京)和東盛生物(廣州)。擴(kuò)增反應(yīng)在Labnet TC9600-G-230V PCR儀上進(jìn)行，結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)由8%聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺=19∶1)120 v/cm電泳1.5 h，置于0.2%AgNO3中染色10 min，加入含0.5%甲醛(V∶V)的1.5%NaOH溶液顯色15 s，條帶清晰后終止反應(yīng)，記錄與分析。

圖1　黑莓雜交組合親本品種系譜

2結(jié)果與分析

2.1　親本的SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性

首先利用78對(duì)引物對(duì)4個(gè)親本品種進(jìn)行了擴(kuò)增，篩選出了多態(tài)性引物。各引物產(chǎn)生的DNA片段中僅考慮擴(kuò)增量最多、染色最深的主帶，結(jié)果顯示78對(duì)引物在4個(gè)親本中有5對(duì)沒(méi)有擴(kuò)增到清晰條帶，其余73對(duì)可擴(kuò)出清晰條帶，其中25對(duì)在4個(gè)親本中具有多態(tài)性(占比32.05%)(見(jiàn)表1)，主帶擴(kuò)增片段大小為70~500 bp。

2.2　雜交優(yōu)株的SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性

利用表1中所列的25個(gè)多態(tài)性引物對(duì)4個(gè)親本品種和6個(gè)雜交優(yōu)株進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，對(duì)各雜交組合及其雜交優(yōu)株的擴(kuò)增產(chǎn)物分別統(tǒng)計(jì)，進(jìn)一步篩選多態(tài)引物，結(jié)果見(jiàn)表2。3個(gè)雜交組合中以Chester×Kiowa的多態(tài)性引物最多，有18對(duì)引物的擴(kuò)增條帶在雙親及其雜交優(yōu)株10-5n-2間顯示差異。雜交組合Hull×Kiowa的多態(tài)性引物最少，僅有6對(duì)引物的擴(kuò)增條帶在雙親及其雜交優(yōu)株10-6n-1和10-6n-1-1間有差異。

表1　黑莓親本品種的多態(tài)性SSR引物及其序列

表2　黑莓親本品種及其雜交優(yōu)株的SSR引物多態(tài)性

2.2.1Kiowa×Arapaho組合中親本及其雜交優(yōu)株的SSR擴(kuò)增結(jié)果12對(duì)多態(tài)引物對(duì)雜交優(yōu)株10-2n-1，10-2n-2和10-2n-5及其母本Kiowa和父本Arapaho的擴(kuò)增結(jié)果如圖2。P4引物的擴(kuò)增結(jié)果顯示3個(gè)優(yōu)株為母本和父本雜交而來(lái)，其中10-2n-1和10-2n-5擴(kuò)增帶型相同，10-2n-2則相對(duì)2者有帶缺失；P7引物表明10-2n-1與父本帶型相同，10-2n-2和10-2n-5帶型相同且與母本相同；P13引物對(duì)3個(gè)優(yōu)株的擴(kuò)增帶型均與母本相同；P15引物顯示為10-2n-5與母本相同，10-2n-1和10-2n-2分別遺傳了父本和母本的部分條帶；P16引物顯示為3個(gè)優(yōu)株雖為雙親雜合類(lèi)型但均有不同條帶缺失；P24引物顯示3個(gè)優(yōu)株均與父本相同；P25引物顯示為10-2n-1與母本帶型相同，其余2者與父本相同且均有條帶缺失；P39引物顯示3個(gè)優(yōu)株帶型均不同，雖證明為雙親雜交但有條帶缺失；P40引物擴(kuò)增10-2n-1與父本相同，10-2n-5與母本相同，10-2n-2為雙親雜合帶型；P55引物擴(kuò)增10-2n-2與父本相同，10-2n-1和10-2n-5均為雙親雜合帶型；P59引物顯示為10-2n-1為雙親雜合帶型但有缺失，10-2n-2中有父本部分帶型，10-2n-5條帶缺失嚴(yán)重；P60引物擴(kuò)增10-2n-2為雙親雜合帶型，10-2n-1和10-2n-5雖為雙親雜合帶型但均有條帶缺失?？傮w來(lái)看，12對(duì)引物中，10-2n-1在6對(duì)中顯示為雜合類(lèi)型，10-2n-2有5對(duì)，10-2n-5有5對(duì)，其余則偏父本或母本一方。另一方面，黑莓遺傳背景具雜合性和復(fù)雜性，雜交過(guò)程中染色體重組和變異明顯，導(dǎo)致3個(gè)優(yōu)株部分雜合條帶在重組中丟失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，可以區(qū)分3個(gè)優(yōu)株的SSR引物有P15，P39，P40，P55，P59和P60。

P4~P60為12對(duì)多態(tài)引物；5個(gè)泳道1組，從左至右分別為母本Kiowa，父本Arapaho，10-2n-1，10-2n-2和 10-2n-5；M，DNA ladder圖2　12對(duì)SSR引物對(duì)優(yōu)株10-2n-1，10-2n-2和10-2n-5及其雙親的擴(kuò)增圖譜

2.2.2Chester×Kiowa組合優(yōu)株擴(kuò)增結(jié)果18對(duì)多態(tài)引物對(duì)雜交優(yōu)株10-5n-2及其母本Chester和父本Kiowa的擴(kuò)增結(jié)果如圖3。P6，P7，P21，P51，P75等引物的擴(kuò)增結(jié)果顯示10-5n-2帶型與母本Chester相同，P28的擴(kuò)增結(jié)果顯示10-5n-2帶型與父本Kiowa相同，P2，P13，P14，P46，P50，P60，P61等引物的擴(kuò)增結(jié)果顯示10-5n-2為雙親雜合類(lèi)型，可將父母本及優(yōu)株加以區(qū)分。而P55，P59，P73等引物的擴(kuò)增結(jié)果也顯示優(yōu)株為雙親雜合帶型但有不同程度條帶缺失，引物P31和P40呈現(xiàn)與父本部分相同但又有新條帶出現(xiàn)?？傮w來(lái)看，10-5n-2總體多擴(kuò)增為雙親重組類(lèi)型，推測(cè)其性狀可能介于雙親之間。

P2~P75為18對(duì)多態(tài)引物；3個(gè)泳道1組，從左至右分別為母本Chester，父本Kiowa和10-5n-2；M，DNA ladder圖3　18對(duì)多態(tài)引物對(duì)優(yōu)株10-5n-2及其雙親的擴(kuò)增圖譜

2.2.3Hull×Kiowa組合優(yōu)株擴(kuò)增結(jié)果6對(duì)多態(tài)引物對(duì)雜交優(yōu)株10-6n-1-1和10-6n-1及其母本Hull和父本Kiowa的擴(kuò)增結(jié)果如圖4。P2引物對(duì)10-6n-1-1的擴(kuò)增結(jié)果顯示了母本的部分條帶，10-6n-1顯示為雙親雜合帶型；P6引物的擴(kuò)增結(jié)果顯示為 10-6n-1-1與父本相同，10-6n-1為父母本雜合類(lèi)型但有條帶缺失；P7引物的擴(kuò)增結(jié)果顯示為10-6n-1-1和10-6n-1分別與父本和母本帶型相同；P13和P14引物的擴(kuò)增結(jié)果顯示2個(gè)優(yōu)株帶型相同且均為雙親雜合類(lèi)型；P17引物擴(kuò)增結(jié)果顯示10-6n-1-1與父本帶型相同，10-6n-1為雙親雜合類(lèi)型。從6對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果總體來(lái)看，2個(gè)雜交優(yōu)株中，10-6n-1-1繼承了較多的父本的特征，10-6n-1顯示為雙親雜合類(lèi)型，與植株表型觀察的結(jié)果基本一致。

P2~P17為6對(duì)多態(tài)引物；4個(gè)泳道1組，從左至右分別為母本Hull，父本Kiowa，10-6n-1-1和10-6n-1；M，DNA ladder圖4　6對(duì)多態(tài)引物對(duì)優(yōu)株10-6n-1-1和10-6n-1及其雙親的擴(kuò)增圖譜

3討論與結(jié)論

SSR標(biāo)記因具有共顯性和多態(tài)性高的特點(diǎn)，作為第2代分子標(biāo)記已被廣泛用于農(nóng)作物和林木品種的鑒定以及苗木真實(shí)性和純度的檢測(cè)[16-17]。由于黑莓遺傳背景相對(duì)復(fù)雜，分子生物學(xué)研究相對(duì)滯后，國(guó)外近年來(lái)關(guān)于黑莓SSR分子標(biāo)記的研究也僅見(jiàn)于少量報(bào)道[14,18]，且主要用于遺傳圖譜構(gòu)建[19]和遺傳多樣性分析[20]。本課題組之前利用78對(duì)已報(bào)道的SSR引物對(duì)黑莓雜交品種寧植2號(hào)進(jìn)行了分析，僅發(fā)現(xiàn)7對(duì)引物在親本間具有多態(tài)性，且其中6對(duì)引物的帶型與母本相同，證明黑莓具有高度雜合的遺傳背景[10]。本研究從78對(duì)引物中共檢測(cè)到25對(duì)在6個(gè)雜交優(yōu)株及其親本中顯示多態(tài)，利用這些多態(tài)性SSR引物分別檢測(cè)了各雜交優(yōu)株及其親本的遺傳特點(diǎn)，結(jié)果顯示10-2n-1，10-2n-2的10-2n-5的多個(gè)位點(diǎn)為雙親雜交類(lèi)型但條帶丟失明顯；10-5n-2為雙親重組類(lèi)型，其性狀可能多介于雙親之間；10-6n-1-1繼承了較多的父本帶型，而10-6n-1顯示為雙親雜合帶型，這些結(jié)果不僅在一定程度上反映了雜交優(yōu)株的遺傳背景，也為進(jìn)一步評(píng)價(jià)這些優(yōu)株及雜交選育提供了借鑒。

在配制的3個(gè)雜交組合所用的4個(gè)親本品種中，Hull和Chester均由美國(guó)馬里蘭州Beltsville試驗(yàn)中心選育，查詢其系譜完全相同(見(jiàn)圖1)，2品種母本和父本基本均由黑莓品種配制而來(lái)。盡管如此，但Hull×Kiowa和Chester×Kiowa組合在相同的SSR引物下擴(kuò)增結(jié)果差異明顯，且相同引物擴(kuò)增的優(yōu)株擴(kuò)增條帶也有不同之處，一定程度上反映了黑莓雜交重組中的復(fù)雜性。Kiowa和Arapaho品種均由美國(guó)阿肯色州Fayetteville黑莓育種試驗(yàn)站選育，其親本也由多個(gè)黑莓品種配制，且含有相同的Darrow和Brazos黑莓品種成分(見(jiàn)圖1)。2品種配制的組合Kiowa×Arapaho獲得的雜交優(yōu)株擴(kuò)增結(jié)果既顯示雜合帶型又顯示條帶缺失或異常，表明黑莓不僅具有高度雜合的遺傳背景，在雜交配制和基因重組中性狀會(huì)嚴(yán)重分離，雜交后代的表現(xiàn)存在不確定性，育種中要優(yōu)選到理想個(gè)體需盡可能增大雜交組合基數(shù)。此外，本研究采用的SSR引物開(kāi)發(fā)自不同懸鉤子中的紅樹(shù)莓和黑莓品種[14-15]。3個(gè)雜交組合中F1優(yōu)株的擴(kuò)增帶型有的呈顯性而有的呈共顯性特征，也表明不同遺傳背景下的懸鉤子開(kāi)發(fā)的SSR引物的適用性值得深入評(píng)價(jià)，要通過(guò)指紋圖譜準(zhǔn)確鑒定育成品種也需開(kāi)發(fā)其自身的SSR引物。

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