雷蕾 （遼寧省沈陽市動物疫病預防控制中心 110034）

血凝和血凝抑制實驗淺談

雷蕾 （遼寧省沈陽市動物疫病預防控制中心 110034）

血凝和血凝抑制實驗在實際操作中被廣泛的使用，主要是因為進行該實驗時步驟流程簡單，不需要長時間的等待實驗結果，最為重要的是實驗結果在很大程度上具有代表性，能夠為人們所接受。通過實驗既能起到保護動物健康的作用，同時，又能為養(yǎng)殖戶提供禽類疾病的預防，文中結合實際經驗敘述該實驗的方法及注意事項，具有非常重要的現(xiàn)實指導意義。

環(huán)境溫度；血凝；血凝抑制

1 血凝和血凝抑制實驗理論和方法

何謂血凝和血凝抑制？前者主要是病毒與血液中的紅細胞發(fā)生的凝集。當發(fā)生凝集現(xiàn)象時，在反應中加入具有抑制作用的物質來阻止凝集，這就是血凝抑制。通常這種物質是具有特異性的血清。不管是兩種實驗中的哪一種，其主要的檢測對象都是血清抗體。血凝實驗的對象一般是選取一種或者是兩種以上的動物，在具體的實際操作過程中所采用的是標準抗原同雞紅細胞。為了達到實驗效果，將病毒或者是還有血凝素的病毒加入抗原同雞紅細胞中，二者之間就會發(fā)生凝集作用。

相較于血凝實驗，要想達到抑制凝集反應的效果，首先要做的是在含有病毒的懸液中加入一些抗體。為了保證實驗效果，對這些抗體有一些客觀上的要求，一方面要具有特異性，另一方面是在實驗量上的保證，要確保能夠達到抑制效果。否則，就會出現(xiàn)紅細胞繼續(xù)發(fā)生凝集反應。

2 被檢樣品

2.1 采樣

（1）首先確定實驗對象的范圍，然后采取一定的抽樣方法選取檢測樣本。在保證所采集的樣本能夠充分代表整個實驗對象的前提下，通過隨機抽樣的方式按照不同的標準進行樣本采集。對屬于同一批次的，按照3%的比例隨機抽樣。對樣本的采集數量也有一定的要求，必須不能少于30，如果低于這個樣本數量的話，那么實驗檢測出來的結果是不具有代表性的。

（2）對所抽選的樣本進行采樣后，要在第一時間內送檢。如果出現(xiàn)特殊情況影響了送檢安排，就必須按照要求對采樣標本進行預處理，要嚴格掌控血清分離的時間。在實驗中，要非常注意對時間的把握。如果分離的時間過長的話，會降低抗體的效價。

2.2 被檢血清

在采集完樣本后，為了達到能夠自然析出血清的效果，我們在實驗中要完成以下兩個步驟：一是將采血器向后回抽2～3ml，二是在前一步驟的基礎上留出空隙，將呈放血清的容器按照一定的角度進行放置。在實驗過程中，要充分考慮到外部環(huán)境的溫度因素。如果實驗是在夏天進行的話，那么就可以將其放在室內。如果是冬天，應該將溫度控制在37℃，要在室內進行析出。如果樣本中出現(xiàn)了血清不易分離的現(xiàn)象，或者是成膠凍狀的話，那么說明所采集的血清抗體含量不均勻，這將會給實驗結果帶來非常大的誤差。在實驗中，對已經分離好的血清按照不同的情況進行處理。如果能夠在短期內檢測，如一周以內，那么就將樣本血清放在4℃冰箱內保存；如果要等待較長的時間，那么就應將樣本血清存放在-20～-80℃的冰箱內，而且在對樣本運輸的過程中，要確保溫度的適宜，可以用冰塊來滿足樣本血清對溫度的需求。

3 反應板

（1）在反應板的選擇上，選用可以一次性使用的96孔V型板。實驗過程中，首先要確保板的質量合格，如果不合格，會嚴重造成實驗結果偏差。還要充分保持反應板及凹孔的干凈，除了干凈之外，還要保證板的平整度，實驗過程中不能有任何的失誤。反應板放置的角度也會影響到實驗的結果，主要是因為放置角度的不同會在一定程度上影響紅細胞的沉降速度，角度的過大或者是過小，會產生不同的結果。

如果實驗中選取的不是一次性使用的反應板，那么在重復使用反應板的過程中，要做好反應板的清潔工作，沒有清潔干凈的反應板會造成實驗結果的不可靠。如果呈放樣本血清的容器中有紅血球殘留的話，那么會給這兩種實驗帶來不同的影響，對血凝實驗，會造成效價偏低，而對抑制實驗，會造成相反的結果。

（2）在實驗過程中，要保證反應板在一定時間內的靜止，不能出現(xiàn)晃動。如果在實驗中，我們對反應板進行過多地操作的話，不停地將其拿在手中進行觀察的話，會嚴重的影響實驗的凝集效果，這樣就會造成血凝實驗效價偏低，而抑制實驗結果偏高。因此，在進行這兩種實驗時，要有一定的耐心，給實驗充足的反應時間，不急于一時，只有這樣才能保證兩種實驗的效果。

4 抗原效價的測定及配制

4.1 抗原的保存

一般在進行這兩種實驗時，所用的抗原是有兩種不同形態(tài)的，液體和干粉。但是不管是以哪種形態(tài)存在，都應該將其設定在-20℃的溫度下進行保存。在進行抗原效價測定時，為了獲得更好的實驗效果，可以將同樣的抗原進行混合使用，而且進行多次實驗，通過多組實驗結果的對比，進行適當的平均，以使得實驗結果更加有效可靠。

抗原的血凝價如果出現(xiàn)以下情況時，會使得效價降低。比如外部溫度變化頻繁。在實驗中，如果出現(xiàn)已經測定好血凝價的抗原有多余的情形，應該將多余的抗原重新裝置，一般將其放置到經過殺菌處理后的離心管中。裝置完以后，要在管上標明相關基本信息，時間和效價，以便下次實驗中繼續(xù)使用。在存放過程中，切忌反復凍融，如果抗原多次這樣操作的話，會使得血凝抑制滴度提高，一般血凝價相差的滴度與血凝抑制價相差的滴度相一致。

4.2 稀釋液

實驗中所用的稀釋液在酸堿性上有非常具體明確的要求。應采用酸堿值為7.2的PBS緩沖液。之所以會以這樣的標準進行選取，主要是為了讓紅細胞能夠更加容易的發(fā)生自凝。如果采用酸堿值過高的稀釋液的話，那么會造成凝集的紅細胞洗脫加快，使得凝集價檢測偏低，凝集抑制價偏高。實驗的每一步操作都是為了提高實驗結果的可靠性。在PBS液的配制上，盡量做到什么時候用什么時候進行調制。在時間方面，要嚴格掌控稀釋液的配制時間。長時間暴露在周圍環(huán)境中，會使得稀釋液受到污染，這樣會滋生細菌，給實驗結果造成偏差。

5 溫度對實驗值的影響

在整個實驗過程中，環(huán)境溫度起到了一個至關重要的作用。在一定的溫度范圍內，血凝和血凝抑制的滴度會隨著溫度的提高相應的作出提高反映。如果室溫出現(xiàn)在低于4℃時，紅細胞會發(fā)生自凝。同時，外部環(huán)境的溫度會影響到實驗的反應速度。如果溫度過高，使得反應在短時間內就完成，不容易被觀察記錄。實驗證明，在37℃時，實驗結果出現(xiàn)的最快，隨著溫度的升高，會出現(xiàn)反應物解離和紅細胞溶血現(xiàn)象。反應過程盡量在恒溫箱中進行，要求恒溫箱溫度能精確保持設定溫度。

正常實驗在20～25℃的條件下進行。在實驗開始30min后，對實驗中產生的現(xiàn)象進行觀察記錄，然后，每隔一段時間記錄一次，在不斷的觀察記錄對比過程中，直到出現(xiàn)最佳觀察結果為止。

6 體會

在整個實驗過程中，除了外部環(huán)境溫度會對實驗結果產生影響，還有其他非常細節(jié)的因素也會左右實驗結果。每個影響因素的存在既是獨立又是交織在一起的。所以，在實驗中，我們一定要嚴格遵守實驗操作規(guī)則，盡可能的排除人為因素對實驗結果的影響。我們可以通過多組實驗的重復操作，來減少實驗中出現(xiàn)的偏差；同時，在進行實驗時，我們的實驗人員要有過硬的專業(yè)技術和實踐經驗，只有做好每一步，才能保證實驗結果的可靠，為實踐提供現(xiàn)實指導。