單莉娟,向陽，李霞,王茂林,秦艷杰,吳迪,白麗雯

(大連海洋大學 遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

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松江鱸脾組織細胞的短期培養(yǎng)及染色體分析

單莉娟,向陽，李霞,王茂林,秦艷杰,吳迪,白麗雯

(大連海洋大學 遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

摘要:采用組織塊法對體質(zhì)量為120~140 g的松江鱸Trachidermus fasciatus脾組織細胞進行短期培養(yǎng)并對染色體進行了分析。結果表明:在pH為7.2、溫度為25 ℃的條件下，松江鱸脾組織細胞在含有20%南美胎牛血清(FBS)、人堿性成纖維樣細胞生長因子(bFGF)、硫酸軟骨素、Ⅰ型胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ)的培養(yǎng)基中，生長良好，遷出細胞有懸浮和貼壁兩種形式；懸浮細胞為圓形和橢圓形，貼壁細胞呈變形細胞樣和成纖維細胞樣；利用懸浮細胞進行的染色體分析顯示，松江鱸的染色體數(shù)2n=40，核型公式為14m+10sm+16t。本研究結果為松江鱸脾組織細胞系的構建奠定了基礎，并初步建立了利用短期培養(yǎng)的脾組織細胞制備染色體的方法。

關鍵詞:松江鱸；脾組織；體外短期培養(yǎng)；染色體

細胞系是病毒學、細胞毒理學、細胞工程、遺傳學和腫瘤學等重要的體外研究體系。1962 年,Wolf 等[1]建立了第一個魚類細胞系——虹鱒生殖腺細胞系RTG-2后，魚類的細胞培養(yǎng)研究進展迅速，現(xiàn)已報道的魚類細胞系有近300個，中國迄今建立的魚類細胞系大約有70多種，主要來自魚類的吻端、腎臟、卵巢、尾鰭、鰾、性腺、肝臟、胚胎(囊胚、原腸胚等) 、鰭條、鰓蓋膜等[2]，對脾組織細胞體外培養(yǎng)的報道僅見大瀧六線魚Hexagrammosotakii[3]、半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis[4]、鱸Lateolabraxjaponicus[5]等。

松江鱸Trachidermusfasciatus又名四鰓鱸，隸屬于鲉形目Scorpaeniformes、杜父魚科Cottidae、松江鱸屬Trachidermus，為小型、底層、肉食、降海溯河性洄游魚類，其分布于日本、朝鮮，以及中國自北向南多個臨近海淡水江河下游廣大地區(qū)[6-8]，是中國渤海、黃海、東海沿岸及其相鄰淡水水域的習見魚類，以其肉味鮮美和體態(tài)多變，被譽為“中國四大名魚”之一[9]。1988年，在中國《國家重點保護動物名錄》中，松江鱸已被列為國家二級保護對象[7]。目前，對松江鱸生物學的研究主要集中在發(fā)育學、遺傳多樣性和基因等方面[10-12]，尚未見其細胞體外培養(yǎng)成功的報道。

魚類染色體常規(guī)的制作方法是采用活體低滲滴片法，該方法不易獲得較多的分裂相。用短期培養(yǎng)的細胞進行染色體制備的報道較少，劉博等[13]采用泥鰍Misgurnusanguillicaudatus鰭細胞進行染色體制備獲得較好的分裂相，朱香萍等[14]利用短期培養(yǎng)的牙鲆Paralichthysolivaceus外周血淋巴細胞制備染色體同樣也獲得較好的分裂相。本研究中，利用體外短期培養(yǎng)的懸浮脾組織細胞，進行染色體制作和分析，以期為魚類染色體的制備提供一種新的方法。

1材料與方法

1.1材料

試驗用松江鱸取自大連市大劉家鎮(zhèn)海域，全長為12~15 cm，體質(zhì)量為120~140 g。取回后暫養(yǎng)于大連海洋大學北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，暫養(yǎng)海水水溫為23 ℃，鹽度為25。

試驗用DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均為Hyclone公司產(chǎn)品；人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、Ⅰ型胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ)均為Peprotech公司產(chǎn)品；硫酸軟骨素為Wolsen公司產(chǎn)品。秋水仙素、甲醇、乙酸、Giemsa染料、甘油、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、甲酸等均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1脾細胞原代培養(yǎng)的啟動參照郭瑩等[15]對大瀧六線魚原代培養(yǎng)的方法，略有改動。將經(jīng)高雙抗消毒海水(含青霉素1000 IU/mL、鏈霉素1000 μg/mL)暫養(yǎng)24 h的鮮活松江鱸放置在無菌室內(nèi)的超凈工作臺上，延腦處死后取其脾組織于無菌的青霉素小瓶中，用PBS和5% FBS-DMEM/F12各漂洗兩次，將組織塊剪成1 mm3碎塊。用5% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基充分懸浮并接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。10 h后，補加培養(yǎng)基至5 mL/瓶。于25 ℃ 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每7 d更換一次培養(yǎng)液，在OLYMPUSCKX41顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2脾組織細胞的染色體制作與分析參考Wang等[16]的方法并稍加改動。收集原代培養(yǎng)10 d的脾組織懸浮細胞，放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2 d，加入秋水仙素，使其終濃度達到1 μg/mL，于25 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，收集培養(yǎng)液于離心管中，以1000 r/min離心10 min后棄上清。用0.075 mol/mL KCl溶液25 ℃下低滲30 min，以1000 r/min離心5 min。用Carnoy液固定3次，每次15 min，并放入冰箱內(nèi)冷凍過夜。采用冷滴片法滴片，室溫下自然干燥。用Giemsa染液染色30 min，自然干燥。在Leica顯微鏡下觀察，統(tǒng)計其染色體數(shù)目并拍照。

2結果與分析

2.1松江鱸脾組織細胞短期培養(yǎng)的生長情況

松江鱸脾組織塊接種到細胞培養(yǎng)瓶24 h后，多數(shù)貼壁牢固。72 h后有細胞從組織塊中遷出，呈懸浮和貼壁生長(圖1-A)。10 d后組織塊周圍遷出細胞數(shù)量增加，貼壁細胞形成生長暈，懸浮細胞分層生長(圖1-B)。37 d后，貼壁細胞基本長滿培養(yǎng)瓶底，細胞類型趨于單一，主要為成纖維細胞樣細胞(圖1-C)。懸浮細胞由于換液，在原瓶中數(shù)量很少。

培養(yǎng)過程中脾組織共遷出4種細胞，分別為懸浮的圓形細胞和橢圓形細胞以及貼壁的變形細胞樣細胞和成纖維細胞樣細胞。培養(yǎng)初期，兩種懸浮的細胞數(shù)量較多(圖1-D)。其中，圓形細胞較其他細胞體積較小，細胞核體積較大且視野下非常明亮，培養(yǎng)早期數(shù)量增加很快；橢圓形細胞，體積較圓形細胞大，細胞核明顯，數(shù)量較圓形細胞少。培養(yǎng)7 d后，遷出的橢圓形細胞數(shù)量明顯減少，培養(yǎng)15 d后，遷出的圓形細胞數(shù)量也逐漸減少。培養(yǎng)7 d后，變形細胞樣和成纖維細胞樣兩種形態(tài)的細胞遷出，變形細胞樣細胞數(shù)量較多，成纖維細胞樣細胞數(shù)量較少。呈變形細胞樣的細胞，大小不一，形狀不規(guī)則，細胞中有大量圓形小泡結構，既有聚集生長，也有單細胞生長，這種類型的細胞隨換液過程細胞數(shù)量逐漸減少(圖1-E)。成纖維樣細胞聚集生長時，細胞鑲嵌排列(圖1-F)，常出現(xiàn)重疊現(xiàn)象；細胞分散生長時，突起較多，形狀不規(guī)則，細胞核周圍有顆粒狀結構。細胞培養(yǎng)37 d后，原瓶中成纖維樣細胞占據(jù)優(yōu)勢，變形細胞樣細胞數(shù)量較少。至60 d時，顯微鏡下基本觀察不到變形細胞樣細胞。成纖維樣細胞存活時間最長，經(jīng)過一次傳代后細胞仍然可以較好地貼壁生長。將早期換液中的懸浮細胞吸出，單獨培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)橢圓形細胞數(shù)量幾乎沒有增加，但圓形細胞數(shù)量有增加并成團聚集生長，染色體分析可獲得大量分裂相。但培養(yǎng)2周后再做染色體分析很難找到分裂相。說明細胞分裂能力減弱或丟失。

2.2染色體分析

對100個圖像清晰、分散較好的中期分裂相細胞的染色體進行統(tǒng)計計數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，染色體數(shù)分布從35到42不等，其中染色體眾數(shù)為40的細胞占全部計數(shù)細胞的53%(圖2)。核型公式為14m+10sm+16t，臂數(shù)為62(圖3)，即松江鱸脾細胞有7組中部著絲點染色體(m)，5對亞中部著絲點染色體(sm)，6對端部著絲點染色體(t)。

3討論

3.1松江鱸脾組織細胞原代培養(yǎng)及細胞類型分析

在魚類細胞培養(yǎng)中，常使用的培養(yǎng)基有DMEM/F12、DMEM和L-15等。本研究中參考大瀧六線魚鰭、吻端、腎組織原代培養(yǎng)[15]的方法，在松江鱸脾組織細胞培養(yǎng)過程中使用含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，與魏云波[17]建立的褐點石斑魚Epinephelusfuscoguttatus3種細胞系、樊廷俊等[18]報道的大黃魚Pseudosciaenacrocea鰭細胞系采用的最適培養(yǎng)基相同。

關于魚類脾組織細胞類型的研究不多，王文君等[3]在對大瀧六線魚脾臟細胞學的研究中發(fā)現(xiàn)5種細胞，即淋巴細胞、紅細胞、巨嗜細胞、基質(zhì)細胞和類內(nèi)皮細胞。本研究中,在對脾組織細胞體外培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)4種細胞，即圓形和橢圓形2種懸浮細胞以及變形細胞樣和成纖維細胞樣2種貼壁細胞。圓形細胞和橢圓形細胞其形態(tài)和游離狀態(tài)與大瀧六線魚的淋巴細胞和紅細胞的形態(tài)相似，而變形細胞樣細胞大小不一，形態(tài)多變，與巨噬細胞形態(tài)相似；成纖維樣細胞可單獨存在，也聚集生長，細胞聚集時交叉排列，形成網(wǎng)狀結構，可能與王文君等[3]報道的基質(zhì)細胞相似。由此推斷，本研究中的4種細胞分別為淋巴細胞、紅細胞、巨噬細胞和基質(zhì)細胞，而類內(nèi)皮細胞未發(fā)現(xiàn)，可能與這類細胞數(shù)量少、分裂慢有關。

注：A大量細胞從組織塊遷出(3 d)；B組織塊周圍長滿單層(10 d)； C細胞長滿單層(37 d)；D實箭頭示懸浮的圓形細胞，空箭頭示懸浮的橢圓形細胞(4 d)；E箭頭示變形細胞樣細胞(7 d)；F箭頭示成纖維細胞樣細胞(7 d)Note:A, the explant and outgrowth of a large number of cells(3 d); B, a monolayer cells surrounding tissue(10 d); C, showing the monolayer of cells(37 d); D, showing suspension of round cells and suspension of oval cells(4 d); E, arrows showing deformation-like cells(7 d); F, arrows showing fibroblast-like cells(7 d)圖1　松江鱸脾組織原代培養(yǎng)細胞Fig.1　Primary cultured cells of spleen in roughskin sculpin

圖2　松江鱸脾細胞染色體數(shù)量分布圖Fig.2　Number frequency of chromosomes in spleen cells of rough skin sculpin

圖3　松江鱸脾細胞的中期分裂相圖Fig.3　Metaphase chromosomes of spleen cells from roughskin sculpin

3.2利用短期培養(yǎng)的松江鱸脾組織細胞進行核型分析的可行性

對魚類染色體的研究中，利用原代培養(yǎng)和早期培養(yǎng)的細胞進行染色體分析的報道不多。原代培養(yǎng)的細胞從組織塊遷出，染色體無變異，是適合染色體分析的良好材料，但存在原代培養(yǎng)細胞數(shù)量少、增殖較慢的問題。本試驗中，在脾組織原代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了極易從組織塊中遷出的數(shù)量較大的呈懸浮生長的類淋巴細胞，在培養(yǎng)早期有明顯的分裂能力，收集后用于做染色體分析，可以獲得大量的分裂相。因此，將魚類脾組織短暫的進行體外培養(yǎng)后，利用類淋巴細胞進行染色體制備，是魚類染色體制作的一個良好方法。

較早的有關松江鱸染色體分析的報道顯示，松江鱸染色體數(shù)目2n=40，與本試驗中得到的結果相同，但臂數(shù)分別為NF=64、NF=60[19]，與本試驗中核型公式14m+10sm+16t，NF=62不盡相同。引起這種差別的原因，可能是由于松江鱸生活的地區(qū)和取樣時間不同造成的。

李樹深[20]指出，在特定的分類類群中，具有較多端部著絲粒染色體的種類為原始類群，而具有較多中部或亞中部著絲粒染色體的是特化類群；染色體臂數(shù)多的類群體比染色體臂數(shù)少的類群特化，同屬于杜父魚科的絨杜父魚Hemitripterusvillosus染色體數(shù)目2n=46，核型公式20m+16sm+10t,NF=82[19]。松江鱸的中部和亞中部著絲粒少于絨杜父魚，端部著絲粒多于絨杜父魚，說明松江鱸是杜父魚科中較早出現(xiàn)的一種魚類。

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Primary culture of spleen and karyotype analysis

in roughskin sculpinTrachidermusfasciatus

SHAN Li-juan, XIANG Yang，LI Xia, WANG Mao-lin, QIN Yan-jie, WU Di,BAI Li-wen

(Key Laboratory of Marine Bio-resource Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province, Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

Abstract：Primary culture of spleen and karyotype analysis wre performed in roughskin sculpin Trachidermus fasciatus with body weight of 120-140 g by a tissue explanting method. The results showed that the optimal growth of spleen cells in roughskin sculpin was observed in the culture medium of DMEM/F12 supplemented with 20% FBS of basic fibroblast growth factor(bFGF), insulin-like growth factor-Ⅰ(IGF-Ⅰ)and chondroitin sulfate at 25 ℃ and pH 7.2. There were two types of growing spleen cells, round and oval suspended cells and cell-like and fibroblast-like adherent cells. The analysis of suspended cells revealed that roughskin sculpin had a diploid chromosome number of 40, with karyotype formula 2n=40，and 14m+10sm+16t. The findings provided a useful foundation for the establishment of in vitro cell-line and the functional investigation in roughskin sculpin spleen，and the chromosome preparation method was preliminarily established using cells of the spleen in roughskin sculpin.

Key words：Trachidermus fasciatus; spleen; cell primary culture; chromosome

通信作者：李霞(1961—)， 女， 教授。E-mail:lx@dlou.edu.cn

作者簡介：單莉娟(1989—)， 女， 碩士研究生。E-mail:xdykx@126.com

基金項目：遼寧省科技廳攻關項目(2011215002)

收稿日期：2014-05-27

中圖分類號：S965.211

文獻標志碼：A

文章編號：2095-1388(2015)02-0161-04

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.009