許國晶，王超，孟慶磊，劉峰，劉飛，陳秀麗

(山東省淡水漁業(yè)研究院 山東省鹽堿地漁業(yè)工程技術研究中心，濟南 250013)

?

用CODEHOP法設計簡并引物克隆草魚多聚免疫球蛋白受體基因片段

許國晶，王超，孟慶磊，劉峰，劉飛，陳秀麗

(山東省淡水漁業(yè)研究院 山東省鹽堿地漁業(yè)工程技術研究中心，濟南 250013)

摘要:為克隆草魚Ctenopharyngodon idellus多聚免疫球蛋白受體pIgR基因，本研究中借助于NCBI、Blast等數據庫及Primer Premier 5.0、DNAMAN等生物軟件，利用CODEHOP法設計了簡并引物，并對克隆基因進行同源性比較和系統發(fā)生分析。結果表明：用CODEHOP法設計的簡并引物特異性強，試驗成功率高；草魚pIgR基因屬于整個脊椎動物的pIgR基因群，與鯉Cyprinus carpio同源性最高,為84%。

關鍵詞:草魚；CODEHOP；多聚免疫球蛋白受體 (pIgR)

黏膜免疫系統作為第一道抵抗外界病毒和細菌入侵的特異性免疫防御屏障，在免疫應答與免疫保護過程中起著極其重要的作用[1-3]。多聚免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor，pIgR)是由黏膜上皮細胞合成，是重要的免疫因子，能夠與分泌型免疫球蛋白(Ig)多聚體結合，介導其跨過上皮細胞進行轉運和分泌，進而保證分泌型免疫球蛋白在黏膜防御屏障中發(fā)揮局部清除病原體及毒素的作用，因此，pIgR的有效分泌是保證分泌型免疫球蛋白發(fā)揮黏膜防御功能的必要條件[4-7]。目前，pIgR基因已在人類、哺乳動物(牛、鼠等)、鳥類和兩棲類中克隆較多[5,8-9]。在硬骨魚中僅有幾種魚類得到克隆，包括對紅鰭東方鲀Takifugurubripes、斑馬魚Daniorerio、大西洋鮭Salmosalar、鯉Cyprinuscarpio、牙鲆Paralichthysolivaceus、斜帶石斑魚Epinepheluscoioides、大菱鲆Scophthalmusmaximus和虹鱒Oncorhynchusmykiss[10-16]等pIgR基因全長cDNA 序列的克隆，對其他魚類未見有關于pIgR基因克隆的報道。本研究中，首次克隆了草魚CtenopharyngodonidelluspIgR基因，為探索其在魚類黏膜免疫中的功能及深入研究pIgR的轉運機制提供理論支撐。

用傳統簡并引物設計出的引物簡并度一般會比較高，同時因引物長度一般小于25個，導致引物退火溫度(Tm)值會偏低，進而造成假陽性較多，不利于RT-PCR擴增[17]。采用CODEHOP法設計引物可降低引物簡并度，提高引物Tm值，從而增強反轉錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)擴增產物的特異性。目前，國內關于應用CODEHOP法克隆水產動物基因僅在對半滑舌鰨CynoglossussemilaevisCYP17 基因的克隆中報道過[18]，本研究中采用CODEHOP(COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)在線軟件設計草魚pIgR基因片段的簡并引物，并利用生物軟件Primer Premier 5.0及DNAMAN對CODEHOP設計的簡并引物進行分析，克隆草魚pIgR基因，該方法較傳統設計簡并引物的方法有較大改進[17,19]，所設計的簡并引物能更好地與模板進行匹配，從而更加有利于RT-PCR試驗的成功，也為今后克隆水產動物基因提供了新的技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗魚草魚取自山東省淡水漁業(yè)研究院，平均體長為36 cm，平均體質量為531 g，保存于液氮中。

1.1.2主要數據庫和生物軟件NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、CODEHOP(http://blocks. fhcrc.org/codehop.html)、Block Maker(http://blocks.fhcrc.org/blockmkr/make_blocks. html)、Primer Premier 5.0、Mega 5.2、DNAMAN。

1.1.3菌體與質?？寺【w采用大腸桿菌DH5α，質粒采用pMD18-T Vector，均購自TaKaRa公司。

1.1.4試劑Trizol試劑購自Invitrogen公司，Gengreen購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)、反轉錄試劑盒均購自Omega公司，LATaq酶、DNA Marker、克隆載體試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1簡并引物的設計首先在NCBI 數據庫中搜索并從中找出3個與草魚親緣關系較近的魚類pIgR氨基酸序列，分別為鯉Cyprinuscarpio(GenBank 登錄號：ADB97624) 、斑馬魚Daniorerio(GenBank 登錄號：ABQ10652) 、大西洋鮭 (GenBank 登錄號：ACX44838)，將上述3種魚類的pIgR氨基酸序列保存為FASTA格式，并提交至BlockMaker 網站，得到保守區(qū)后，從BlockMaker Results網頁直接登錄CODEHOP 數據庫在線進行引物設計。設計引物的主要參數：Degeneracy為128，Temperature為60.0 ℃，Genetic code為standard，Codon usage table為Daniorerio。引物密碼表中沒有草魚選項，所以選擇進化地位較近的模式生物D.rerio。

1.2.2簡并引物的篩選首先根據簡并引物設計的普遍原則和引物退火溫度值，篩選出分值較高的引物，盡量選擇分數大于75分的引物。然后根據簡并引物在氨基酸序列保守區(qū)內的位置，篩選出簡并度較低的引物。再在3種魚中選出其中一種魚(與要克隆的物種親緣關系盡量相近)，采用DNAMAN查看篩選出的簡并引物在其mRNA模板中的位置，并分析簡并引物與模板mRNA的匹配程度，選取匹配程度較高的引物。最后再利用Primer Premier 5.0進行簡并引物自身的檢測：(1)分析兩條上、下游簡并引物自身是否存在發(fā)夾結構；(2)兩條上、下游簡并引物之間是否存在二聚體；(3)兩條上、下游簡并引物的Tm值不要相差太大，盡量不要超過5 ℃。

1.2.3簡并擴增草魚pIgR基因選取草魚肝組織進行總RNA提取。RNA提取步驟按照Trizol試劑盒說明書進行，操作過程中注意防止RNA酶污染。反轉錄過程按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行，再用已經篩選好用CODEHOP法設計的簡并引物及用傳統方法設計的同樣保守區(qū)的簡并引物進行RT-PCR擴增。

篩選出的用CODEHOP法設計的簡并引物：

上游引物5′ CTCAGTACATCTCCTACGTGaartaytggtg 3′；

下游引物5′ TCCGGATCGGCACcanykyttytc 3′。

篩選出的用傳統方法設計的簡并引物：

上游引物5′ CGCARTACRYCAGYHAYGTGAA-GTACTGGTG 3′；

下游引物5′ HCCACTRCGACACCAMYGCTTCT-C 3′。

PCR 反應體系(共25 μL)： 10×Taqbuffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，cDNA模板 0.5 μL、上、下游引物各1 μL，TaqDNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。采用降落PCR的反應程序：94 ℃下預變性5 min；94 ℃下變性30 s， 64~55 ℃下退火30 s(每一循環(huán)降1 ℃，之后為55 ℃)，72 ℃下延伸90 s，共進行30個循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min。將PCR產物于4 ℃下保存。

1.2.4PCR 產物分析反轉錄PCR產物在含Gengreen的瓊脂糖凝膠(10 g/L)上進行檢測，經檢測含有目的片段后利用Omega瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收。將回收的特異性目的片段采用克隆載體試劑盒連接入pMD18-T Vector，轉化至大腸桿菌DH5α中，在氨芐青霉素平板上涂布，挑取平板上的單菌落，以載體通用引物(Primer RV-M和Primer M13-47)進行PCR檢測，經檢測正確后，搖菌并測序。

1.2.5序列分析將生工生物工程(上海)有限公司的測序結果通過NCBI Blast進行序列比對，分析草魚pIgR基因序列與其他物種的同源性。

1.2.6系統進化分析將不同物種的pIgR氨基酸序列通過ClustalX進行多序列比對后，用Mega 4.0軟件的鄰位相接法(Neighbor-joining,NJ)構建系統進化樹。

2結果與分析

2.1用CODEHOP設計簡并引物

采用BlockMaker對鯉、斑馬魚、大西洋鮭的pIgR氨基酸序列進行保守區(qū)分析比對后，共得到7個非常保守的氨基酸區(qū)域。再采用CODEHOP設計的簡并引物，經過DNAMAN、Primer Premier 5.0分析，最終篩選出如表1所示的1對引物。

表1　上下游簡并引物

注：大寫字母表示5′端的非簡并夾板區(qū)，小寫字母表示3′端的核心簡并區(qū)

Note:Capital letters represent 5′non- degenerate consensus clamp,and letters represente 3′ degenerate core

2.2簡并PCR電泳結果

以草魚肝臟RNA為模板(圖1)，用CODEHOP設計的簡并引物進行擴增，電泳結果如圖2-A所示,在455 bp處出現一條特異性條帶，與推斷的結果基本一致，并且沒有出現非特異性條帶。而用傳統方法設計的簡并引物進行擴增，電泳結果如圖2-B所示,在400～500 bp處出現多條帶，PCR擴增產物特異性不強。因此,在后續(xù)進行PCR產物分析及測序時均采用CODEHOP設計的簡并引物及其進行擴增的PCR產物。

圖1　草魚肝組織總RNA瓊脂糖電泳結果Fig.1　Agarose electrophoresis of total RNA in hepatopancreas of grass carp Ctenopharyngodon idellus

注：A為CODEHOP法；B為傳統方法Note:A,CODEHOP;B,the traditional method圖2　草魚肝組織RT-PCR電泳圖譜Fig.2　Electrophoresis of RT-PCR in hepatopancreas of grass carp Ctenopharyngodon idellus

2.3測序結果及序列分析

測序結果如圖3所示,將測序結果通過NCBI BlastX進行同源性比較,結果如表2所示。從表2可見：克隆的草魚pIgR氨基酸序列與鯉的同源性最高(84%)，其次為斑馬魚(75%)，與虹鱒、大西洋鮭、斜帶石斑魚、大菱鲆、紅鰭東方鲀、牙鲆、大西洋鱈pIgR氨基酸序列的同源性為50%~59%。由此可見，草魚pIgR基因片段屬于整個脊椎動物的pIgR基因群。經Sequin提交，得到草魚pIgR基因序列的GenBank登錄號為KP238177，該片段編碼151個氨基酸。

圖3　草魚pIgR基因片段Fig.3　Fragment of pIgR gene from grass carp Ctenopharyngodon idellus

物種species GenBank登錄號accessionNo.分值maxscore期望值Evalue同源性identity/%鯉CyprinuscarpioADB97624.12451e-7784斑馬魚DaniorerioABQ10652.12384e-7675虹鱒OncorhynchusmykissADB81776.11811e-5258大西洋鮭SalmosalarACX44838.11812e-5258斜帶石斑魚EpinepheluscoioidesACV91878.11774e-5159大菱鲆ScophthalmusmaximusAGN54539.11768e-5159牙鲆ParalichthysolivaceusADK91435.11608e-4555紅鰭東方鲀TakifugurubripesNP_001266944.11571e-4353大西洋鱈GadusmorhuaAIR74929.11403e-3750

2.4系統進化分析

通過構建18種動物的pIgR 氨基酸序列系統進化樹，研究草魚pIgR在進化上的保守性。其中9種動物pIgR氨基酸序列的GenBank登錄號見表2，除魚草外其余8種動物及pIgR 氨基酸序列的GenBank登錄號分別為人Homosapiens(CAA51532.1)、褐家鼠Rattusnorvegicus(EDM09843.1)、牛Bostaurus(AAC41620.1)、小家鼠Musmusculus(AAA67440.1)、馬Equuscaballus(ACX69975.1)、雞Gallusgallus(AAP69598.1)、非洲爪蛙Xenopuslaevis(ABK62772.1)和眼鏡王蛇Ophiophagushannah(ETE63349.1)。從圖4可見：該進化樹主要分成3部分，第一部分是哺乳類(包括人、牛、馬、小家鼠、褐家鼠)，第二部分是鳥類(雞)、爬行類(眼鏡王蛇)和兩棲類(非洲爪蛙)，第三部分是硬骨魚類；在硬骨魚類中，草魚pIgR氨基酸序列與鯉最接近，其次與斑馬魚較近。

圖4　根據不同物種pIgR氨基酸序列構建的系統進化樹Fig.4　Phylogenetic tree constructed for the amino acid sequences of pIgR in different species

3討論

用CODEHOP設計的簡并引物與用傳統方法設計的簡并引物不同，分為3′端的核心簡并區(qū)和5′端的非簡并夾板區(qū)兩部分。3′端核心簡并區(qū)由小寫字母表示，是由9~12個編碼高度保守的氨基酸堿基序列組成，在RT-PCR擴增中與最相近的cDNA進行匹配；5′端是非簡并夾板區(qū)，其長度略長，用大寫字母表示。因CODEHOP法設計的簡并引物的非簡并夾板區(qū)最大程度地反推了保守氨基酸的堿基序列，使后續(xù)RT-PCR擴增具有較強的特異性，也使得CODEHOP方法優(yōu)于特異性較差的傳統簡并PCR方法。傳統方法通常不適用于擴增物種間親緣關系較遠或序列拷貝數較低的情況，而CODEHOP法則適用[18,20]。在用CODEHOP設計簡并引物時，會檢索出大量的引物序列，因此，需要進行仔細篩選。本研究中，先利用CODEHOP設計出簡并引物，再用DNAMAN對上下游引物與其中1種魚模板mRNA進行比對，查看其匹配程度，再用Primer Premier 5.0對簡并引物自身進行分析(發(fā)夾結構、Tm值、二聚體)，從而為后續(xù)試驗的成功奠定了基礎。本試驗結果表明，用CODEHOP法設計的簡并引物進行RT-PCR擴增，產物特異性強，沒有雜帶，明顯優(yōu)于傳統方法。

在脊椎動物黏膜免疫中，多聚免疫球蛋白的轉運和分泌需要一系列免疫分子和免疫細胞的協同作用。其中多聚免疫球蛋白受體pIgR就是起重要作用的免疫分子，它可以很好地與分泌型多聚免疫球蛋白結合，從而介導其向黏膜擴散。在哺乳動物中，pIgR含有5個類似Ig結構功能區(qū)(Ig-like domain,ILD1~ILD5)，鳥類(雞)和兩棲類(非洲爪蟾)pIgR含有4個Ig樣功能區(qū)[6,9]，而魚類pIgR被證明僅含有2個Ig樣功能區(qū)，分別和哺乳動物的ILD1和ILD5相對應[10-16]。對紅鰭東方鲀和牙鲆的研究結果表明，魚類pIgR中2個ILDs能很好地結合分泌型Ig[10,16]，說明魚類pIgR轉運分泌型四聚體IgM需要ILDs功能區(qū)少，而轉運哺乳動物、鳥類或兩棲類中分泌型IgA二聚體或IgA三聚體，則需要4~5個ILDs功能區(qū)。Norderhaug等[21]研究表明，如果pIgR敲除Ig樣功能區(qū)2和Ig樣功能區(qū)3，則不能與分泌型IgA多聚體結合。推測原因，可能是因為IgA二聚體或IgA三聚體中間的亞基距離較遠，而IgM四聚體則縮小了亞基之間的空間距離，因此，需要pIgR的ILDs功能區(qū)也較少。但真正的結合模式還需要進行深入地研究[22]。本研究中成功地克隆了草魚pIgR基因，經分析得出，草魚pIgR基因屬于整個脊椎動物的pIgR基因群，尤其是硬骨魚類亞群。

本研究為后續(xù)研究pIgR在健康草魚不同組織中的差異表達情況及免疫應答特征、蛋白結構特征奠定了基礎，不僅豐富了魚類黏膜免疫方面的基本理論，用于更好地指導生產實踐，更為深入地研究草魚pIgR在黏膜免疫球蛋白轉運過程中的作用機制提供了理論支撐。

參考文獻：

[1]Santos N M S D,Taveme-Thiele J J,Bames A C,et al.The gill is a major organ for antibody secreting cell production following direct immersion of sea bass (DicentrarchuslabraxL.) in aPhotobacteriumdamselaessp.piscicida bacterin:an ontogenetic study[J].Fish and Shellfish Immunology,2001,11(1):65-74.

[2]Xu D H,Klesius P H,Shelby R A.Cutaneous antibodies in excised skin from channel catfish,IctaluruspunctatusRafinesque,immune toIchthyophthiriusmultifiliis[J].Journal of Fish Diseases,2002,25(1):45-52.

[3]Cain K D,Jones D,Raison R L.Characterization of mucosal and systemic immune response in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) using surface plasmon resonance[J].Fish and Shellfish Immunology,2000,10(8):651-666.

[4]Gurevich P,Zusman I,Moldavsky M,et al.Secretory immune system in human intrauterine development:immunopathomorphological analysis of the role of secretory component (pIgR/SC) in immunoglobulin transport (review)[J].International Journal of Molecular Medicine,2003,12(3):289-297.

[5]Kaetzel C S.The polymeric immunoglobulin receptor:bridging innate and adaptive immune responses at mucosal surfaces[J].Immunological Reviews,2005,206:83-99.

[6]Braathen R,Hohman V S,Brandzaeg P,et al.Secretory antibody formation:conserved binding interactions between J chain and polymeric Ig receptor from humans and amphibians[J].Journal of Immunology,2007,178(3):1589-1597.

[7]唐慶娟,戚欣,耿美玉.多聚免疫球蛋白受體(pIgR) 在黏膜免疫中的重要功能[J].中國生物化學與分子生物學報,2007,23(9):724-729.

[8]Asano M,Saito M,Fujita H.Molecular maturation and functional expression of mouse polymeric immunoglobulin receptor[J].Journal of Immunological Methods,1998,214:131-139.

[9]Wieland W H,Orzaez D,Lammers A,et al.A functional polymeric immunoglobulin receptor in chicken (Gallusgallus) indicates ancient role of secretory IgA in mucosal immunity[J].Biochemical Journal,2004,380:669-676.

[10]Hamuro K,Suetake H,Saha N R,et al.A teleost polymeric Ig receptor exhibiting two Ig-like domains transports tetrameric IgM into the skin[J].Journal of Immunology,2007,178:5682-5686.

[11]Rombout J H W M,van der Tuin S J L,Yang G,et al.Expression of the polymeric Immunoglobulin Receptor (pIgR) in mucosal tissues of common carp (CyprinuscarpioL.)[J].Fish and Shellfish Immunology,2008,24:620-628.

[12]Feng L N,Lu D Q,Bei J X,et al.Molecular cloning and functional analysis of polymeric immunoglobulin receptor gene in orange-spotted grouper (Epinepheluscoioides)[J].Comparative Biochemistry and Physiology B，2009,154:282-289.

[13]Zhang Y A,Salinas I,Li J,et al.IgT,a primitive immunoglobulin class specialized in mucosal immunity[J].Nature Immunology,2010,11:827-835.

[14]Tadiso T M,Sharma A,Hordvik I.Analysis of polymeric immunoglobulin receptor and CD300-like molecules from Atlantic salmon[J].Molecular Immunology,2011,49(3):462-473.

[15]Xu G J,Zhan W B,Ding B J,et al.Molecular cloning and expression analysis of polymeric immunoglobulin receptor inounder (Paralichthysolivaceus)[J].Fish and Shellfish Immunology,2013,35:653-660.

[16]丁冰潔,繩秀珍,唐小千.大菱鲆多聚免疫球蛋白受體基因的克隆及表達分析[J].中國水產科學,2013,20(4):792-801.

[17]黃菁,王少麗,喬傳令.程序化設計簡并引物與克隆小菜蛾酯酶基因[J].昆蟲知識,2002,39(6):458-461.

[18]陳彩芳,溫海深,何峰,等.程序化設計的簡并引物克隆半滑舌鰨CYP17基因[J].中國海洋大學學報:自然科學版，2009,39(6):1213-1218.

[19]夏瑞,陸旺金,李建國.簡并引物的程序化設計與荔枝HMGR基因片段的克隆[J].果樹學報,2006,23(6):903-906.

[20]李運合,孫光明.利用CODEHOP和iCODEHOP設計簡并引物克隆芒果LAX基因家族片段[J].熱帶作物學報,2011,32(12):2278-2282.

[21]Norderhaug I N,Johansen F E,Krajci P,et al.Domain deletions in the human polymeric Ig receptor disclose differences between its dimeric IgA and pentameric IgM interaction[J].European Journal of Immunology,1999,29(10):3401-3409.

[22]王磊.鯉魚多聚免疫球蛋白受體(cpIgR)功能的研究[D].濟南:山東師范大學,2009:27-29.

Cloning of polymeric immunoglobulin receptor gene fragment

in grass carpCtenopharyngodonidellususing degenerate

primers designed by CODEHOP

XU Guo-jing, WANG Chao, MENG Qing-lei, LIU Feng, LIU Fei，CHEN Xiu-li

(Saline-alkali Fishery Engineering Technology Research Center of Shandong Province, Freshwater Fisheries Research Institute of Shandong Province, Jinan 250013, China)

Abstract：The gene of polymeric immunoglobulin receptor(pIgR)of grass carp Ctenopharyngodon idellus was cloned by a pair of degenerate primers designed by CODEHOP, and by combined bioinformatics including NCBI, Blast and biological software such as Primer Premier 5.0 and DNAMAN, and the homology and phylogenetic tree of the clone of pIgR gene were analyzed in the PCR products. The results showed that degenerate primers designed by CODEHOP were characterized by specificity and benefit for the experiment accomplishing. pIgR gene of grass carp was found to clustered into pIgR gene group in all the other vertebrates, especially into the fish subgroup, with the maximal homology (84%) with common carp Cyprinus carpio.

Key words：Ctenopharyngodon idellus; CODEHOP; polymeric immunoglobulin receptor (pIgR)

作者簡介：許國晶(1984—)， 女， 博士。E-mail:guojingxu18@sina.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31440090)；山東省農業(yè)良種工程項目；山東省財政支持農業(yè)技術推廣項目

收稿日期：2014-12-29

中圖分類號：S965.111;Q512.2

文獻標志碼：A

文章編號：2095-1388(2015)02-0138-05

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.005