石云良，李莉萍，王瑞，梁萬(wàn)文，甘西，

黃婷1，李健2、3，黃維義2、3，陳明1

(1.廣西水產(chǎn)科學(xué)院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；2.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005；

3.廣西大學(xué) 食品質(zhì)量與安全研究中心，南寧 530005)

?

羅非魚(yú)源Ia和Ib血清型無(wú)乳鏈球菌可溶性蛋白差異分析

石云良1、2、3，李莉萍1，王瑞1，梁萬(wàn)文1，甘西1，

黃婷1，李健2、3，黃維義2、3，陳明1

(1.廣西水產(chǎn)科學(xué)院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；2.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005；

3.廣西大學(xué) 食品質(zhì)量與安全研究中心，南寧 530005)

摘要:前期研究表明，羅非魚(yú)Oreochromis niloticus Ia和Ib血清型無(wú)乳鏈球菌Streptococcus agalactiae疫苗之間缺乏交叉保護(hù)力，為了從蛋白分子水平探討其免疫原性差異的原因，在提取羅非魚(yú)Ia和Ib血清型無(wú)乳鏈球菌可溶性蛋白后應(yīng)用二維差異凝膠電泳(two dimension-Difference Gel Electrophoresis,2D-DIGE)分析其表達(dá)差異蛋白點(diǎn)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定這些差異蛋白，并使用DAVID生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)經(jīng)鑒定后獲得的蛋白功能。結(jié)果表明：在2D-DIGE電泳上，Ia和Ib兩種不同血清型無(wú)乳鏈球菌具有167個(gè)表達(dá)差異蛋白點(diǎn)，對(duì)這些蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析獲得32種蛋白，這些蛋白主要與氧化還原反應(yīng)、代謝與能量前體物產(chǎn)生、糖代謝反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，主要參與糖解和糖異生作用、丙酮酸代謝與脂肪酸生物合成等通路；對(duì)蛋白功能的預(yù)測(cè)表明，GAPGH、半胱氨酸合成酶和錳依賴性錳超氧化物歧化酶的功能與免疫和疫苗研發(fā)相關(guān)。本研究首次證實(shí),羅非魚(yú)Ia和Ib血清型無(wú)乳鏈球菌存在較多的表達(dá)差異蛋白，部分表達(dá)差異蛋白的功能與免疫和疫苗研發(fā)相關(guān)，這可能與鏈球菌免疫原性有直接關(guān)系，但需要進(jìn)一步地研究和證實(shí)。

關(guān)鍵詞:羅非魚(yú)；無(wú)乳鏈球菌；Ia和Ib血清型；可溶性蛋白；二維差異凝膠電泳(2D-DIGE); 差異分析

鏈球菌Streptococcosis病是羅非魚(yú)Oreochromisniloticus養(yǎng)殖中危害最為嚴(yán)重的病害，呈全球性流行，每年給世界羅非魚(yú)養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2009—2012年該病給中國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失累計(jì)達(dá)16億美元[1]。至今尚未找到有效的藥物治療方法和預(yù)防控制措施。

為了獲得新的疫苗候選分子和新藥物靶點(diǎn)，已有學(xué)者開(kāi)始對(duì)魚(yú)鏈球菌蛋白組進(jìn)行相關(guān)的鑒定研究。Hughes 等[2]分離和提取無(wú)乳鏈球菌Streptococcusagalactiae可作為疫苗候選分子的菌體外層蛋白，用2D電泳分離后經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定獲得14種蛋白，其中6種為用無(wú)乳鏈球菌首次鑒定的蛋白。Shin等[3]對(duì)海豚鏈球菌的可溶性蛋白進(jìn)行2D電泳分離，獲得大約320個(gè)蛋白點(diǎn)，對(duì)部分高豐度表達(dá)的蛋白進(jìn)行多肽質(zhì)譜分析獲得17種不同的蛋白，這些蛋白的鑒定為篩選診斷候選分子和疫苗候選分子奠定了良好的基礎(chǔ)。

已有研究證實(shí)，羅非魚(yú)Ia與Ib血清型無(wú)乳鏈球菌的全菌苗之間未能產(chǎn)生有效的交叉保護(hù)[4]。為此，本研究中擬從蛋白分子水平分析這兩種不同血清型無(wú)乳鏈球菌可溶性蛋白的差異，通過(guò)蛋白功能預(yù)測(cè)初步探討這些差異蛋白與免疫原性之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

Ia血清型菌株分離自廣西的羅非魚(yú)(編號(hào)GX032)，Ib菌株血清型分離自海南省的羅非魚(yú)(編號(hào)HN016)。

1.2方法

1.2.1菌株的分離培養(yǎng)和鑒定無(wú)菌條件下采集患病羅非魚(yú)的腦、肝和鰭條基部并劃線接種于血平板上，28 ℃下培養(yǎng)24～48 h；對(duì)菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察，并挑取染色結(jié)果為鏈球菌的單個(gè)菌落進(jìn)行純化；純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落于TSB中(28 ℃)培養(yǎng)24～48 h，加入20%甘油置于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存或直接使用。羅非魚(yú)的GX032和HN016血清型無(wú)乳鏈球菌使用API 20 Strep系統(tǒng)(Bio Merieux, Marcyl’Etoile,France)進(jìn)行鑒定，培養(yǎng)溫度為25 ℃。

1.2.2細(xì)菌可溶性蛋白的提取將250 mL細(xì)菌培養(yǎng)液[密度為(2.0~5.0)×108cells/mL)]在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，沉淀用PBS洗滌3次后加入2 mL裂解緩沖液(包含7 mol/L尿素、2 mol/L硫尿、4% CHAPS、30 mmol/L Tris-HCl), 反復(fù)凍融6次，每次15 min，然后在冰上用超聲波粉碎45 min (超聲10 s，間隔20 s，振幅70%)，在4 ℃下以15 000 r/min 離心30 min，收集上清可溶性蛋白于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。用Bradford法蛋白定量測(cè)定蛋白濃度[5]，以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，制作蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3兩種不同血清型菌株可溶性蛋白的2D電泳分析2D 電泳參照Pressey等[6]的方法，具體如下：

(1)加樣品水化。將50 μg蛋白與水化液(包含8 mol/L尿素、2% CHAPS、0.01 g DTT、0.5% Bio-Lyte)充分混勻過(guò)夜，將18 cm固定pH梯度膠條(pH 3~10,GE Life Sciences公司)在室溫下放置10 min后加入樣品，然后用IPGphor(Amersham)進(jìn)行電泳。步驟如下：步驟1,30 V下運(yùn)行6 h；步驟2,60 V下運(yùn)行7 h；步驟3,200 V下運(yùn)行1 h；步驟4,500 V下運(yùn)行1 h； 步驟5,1000 V下運(yùn)行1 h；步驟6，8000 V下運(yùn)行1 h；步驟7，8000 V下運(yùn)行6 h；步驟8，500 V下運(yùn)行1 h，停止。

(2)膠條的平衡。膠條在含有64.8 mmol/L DTT 的 SDS 平衡緩沖液(包含50 mmol/L pH為 8.8的Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%甘油、2% SDS、0.002%溴酚藍(lán))中還原10 min，然后在含135.2 mmol/L碘乙酰胺的平衡緩沖液中烷基化15 min。將 IPG膠條輕輕潤(rùn)洗，去除多余平衡緩沖液，再將IPG膠條轉(zhuǎn)移至大試管中，加入平衡緩沖液Ⅰ(包含6 mol/L尿素、50 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、2%SDS+0.1%DTT)后,將試管放在水平搖床上緩慢搖晃15 min。第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉膠條平衡緩沖液Ⅰ，并用濾紙吸取多余平衡液。再加入膠條平衡緩沖液Ⅱ(包含6 mol/L尿素、50 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、2%SDS+4%碘乙酰胺)，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15 min，平衡結(jié)束后，徹底倒掉樣品水化盤(pán)中的膠條平衡緩沖液Ⅱ，并用濾紙吸取多余平衡液。將IPG膠條從試管移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸沒(méi)在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上。將制備好的15%丙烯酰胺SDS-PAGE膠用低熔點(diǎn)瓊脂糖封頂，將IPG膠與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸，放置5 min使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中進(jìn)行SDS-PAGE電泳(Ettan DALT Twelve system，Amersham)。起始時(shí)用低電流(5～10 mA/gel/17 cm)運(yùn)行，待樣品在完全跑出IPG膠條并濃縮成一條線后再加大電流(20～30 mA/gel/17 cm)運(yùn)行，直到溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。電泳后的蛋白凝膠參照銀染試劑盒(Thermo Scientific)說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行染色，然后在成像系統(tǒng)下進(jìn)行成像。另外，制作一塊主質(zhì)膠(Master膠)，分別加入150 μg GX032、HN016可溶性蛋白以及150 μg GX032與HN016等量混合且未標(biāo)志的樣品進(jìn)行2D電泳后再銀染，與2D-DIGE蛋白凝膠進(jìn)行比較分析，找到相對(duì)應(yīng)的差異蛋白點(diǎn)后，在Master膠上進(jìn)行挖點(diǎn)和質(zhì)譜分析。

1.2.4兩種不同血清型菌株可溶性蛋白的2D-DIGE電泳

(1) 熒光標(biāo)志。在熒光標(biāo)志前將蛋白先用含有蛋白酶抑制劑的重泡張緩沖液(包含7 mol/L 尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、40 mmol/L二硫蘇糖醇、0.5%兩性電解質(zhì)、0.002%溴酚藍(lán) 2.5 mL)調(diào)節(jié)濃度為50 μg/125 μL。按照蛋白熒光標(biāo)志試劑盒(GE Life Sciences公司)說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行標(biāo)記。分別用400 pmol Cy3和Cy5標(biāo)志50 μg的Ia和Ib血清型鏈球菌可溶性蛋白；50 μg等量混合的Ia和Ib血清型鏈球菌可溶性蛋白液則用Cy2標(biāo)志，作為內(nèi)參對(duì)照。

(2) 2D-DIGE電泳。與“1.2.3”節(jié)相同。

1.2.5差異蛋白點(diǎn)的分析SDS-PAGE凝膠用Typhoon 9410成像系統(tǒng)(Amersham)進(jìn)行掃描，用DeCyder 2D 5.02軟件(GE Life Sciences公司)分析不同血清型鏈球菌可溶性蛋白的各個(gè)差異點(diǎn)。用Typhoon 9410掃描儀分別在488 nm/520 nm、532 nm/580 nm、633 nm/670 nm波長(zhǎng)下對(duì)Cy2、Cy3、Cy5熒光染料標(biāo)志的圖像進(jìn)行掃描。用DeCyder 6.5軟件對(duì)DIGE圖像進(jìn)行分析和差異點(diǎn)尋找。差異點(diǎn)判定條件：P≤0.05，差異倍數(shù)1.5倍以上。

1.2.6質(zhì)譜的鑒定和分析根據(jù)Master膠比對(duì)2D-DIGE 圖，有顯著差異的蛋白點(diǎn)從Master 膠上挖出，用胰蛋白酶消化、還原，再烷基化， 最后置于基質(zhì)上進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析(美國(guó)ABI-4800型反射式基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜)。掃描方式：反射式,蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的掃描范圍為700~4000；激光能量，MS為5000，MSMS為5500；GPS軟件檢索，MS誤差為0.2，MSMS誤差為0.3；數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，NCBI_bacteria_protein_faa_2012_0704。數(shù)據(jù)取舍標(biāo)準(zhǔn)：取蛋白打分大于72分，置信水平在95%以上。鑒定獲得蛋白使用在線軟件DAVID Bioinformatics Resources 6.7(http://david.abcc.ncifcrf.gov)進(jìn)行Gene Ontology分析和KEGG Pathway分析。

2結(jié)果與分析

2.1GX032(Ia)和HN016(Ib) 2D電泳結(jié)果

兩種不同血清型鏈球菌可溶性蛋白的2D電泳和銀染結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下兩種鏈球菌可溶性蛋白在2D電泳中得到了很好的分離(圖1)，為2D-DIGE電泳的進(jìn)行奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.22D-DIGE 電泳結(jié)果

將GX032(Ia)和HN016(Ib)以及GX032與HN016等量混合的可溶性蛋白，分別標(biāo)記后進(jìn)行2D-DIGE電泳，結(jié)果表明，在分離蛋白等電點(diǎn)pI 為3~10 時(shí)的各種蛋白得到很好的分離(圖2)。使用DeCyder 2D 5.02 軟件進(jìn)行差異蛋白點(diǎn)分析，根據(jù)差異點(diǎn)判定條件(P≤0.05，蛋白差異倍數(shù)1.5倍以上)判定，獲得 167個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。

2.3Master膠差異蛋白點(diǎn)標(biāo)志結(jié)果

分別將150 μg的GX032(Ia)和HN016(Ib)以及150 μg GX032與HN016等量混合且未標(biāo)記的可溶性蛋白進(jìn)行2D 電泳，銀染后與2D-DIGE電泳凝膠比較，獲得相對(duì)應(yīng)的差異蛋白點(diǎn)，在Master膠上對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)志(圖3)。

注：A為GX032(Ia)可溶性蛋白;B為HN016(Ib)可溶性蛋白Note：A，GX032(Ia)soluble protein；B，HN016(Ib)soluble protein圖1　GX032(Ia)和HN016(Ib)可溶性蛋白的2D 電泳凝膠銀染結(jié)果Fig.1　2D electrophoresis of GX032(Ia)and HN016(Ib)soluble protein with silver staining

注：50 μg Ia和Ib可溶性蛋白分別用 Cy3和Cy5進(jìn)行標(biāo)志，50 μg等量Ia和Ib混合樣品用Cy2進(jìn)行標(biāo)志。蛋白點(diǎn)為紫色或是綠色說(shuō)明蛋白濃度含量很高Note:50 μg Ia and Ib soluble protein is labeled with Cy3 and Cy5, respectively.50 μg equal volume of Ia and Ib mixture is labeled with Cy2.The abundance protein spots is shown in purple and green圖2　Ia和Ib血清型無(wú)乳鏈球菌可溶性蛋白2D-DIGE結(jié)果Fig.2　2D-DIGE of soluble proteins extracted from Ia and Ib serotypes of Streptococcus agalactiae

2.4差異蛋白鑒定結(jié)果

對(duì)Master膠上的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，并進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)分析后，鑒定獲得32種蛋白(表1)。這些蛋白大部分為酶類(lèi)，主要為氧化還原酶[乙偶姻還原酶、L-2-羥基己酸脫氫酶、3-酮脂酰-(?；d體蛋白)還原酶等]、合成酶[半胱氨酸合成酶、F0F1 ATP合酶γ亞基、3-氧化?；?(酰基載體蛋白)合成酶Ⅱ]和轉(zhuǎn)移酶(轉(zhuǎn)酮醇酶、丙酮酸激酶和磷酸甘油酸激酶)。

表1　Ia和Ib血清型無(wú)乳鏈球菌差異蛋白鑒定結(jié)果

注：1)Master膠內(nèi)蛋白點(diǎn)的編號(hào)；2)Ib與Ia的蛋白豐度比值，負(fù)數(shù)表示下調(diào)

Note：1)Number of protein spots on the master gel;2)the ratio of Ib and Ia protein expression abundance;-，down regulated

2.5蛋白功能分析

根據(jù)DAVID Bioinformatics Resources 6.7在線軟件分析結(jié)果表明，這32種差異蛋白(差異倍數(shù)>1.5,P≤0.05)主要與氧化還原反應(yīng)、能量與代謝前體物產(chǎn)生、糖代謝反應(yīng)等12個(gè)生物學(xué)過(guò)程有關(guān)(圖4)；主要參與糖解和糖異生作用、丙酮酸代謝、脂肪酸生物合成、丁酸甲酯代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝和C5支鏈二元酸代謝6個(gè)通路(圖5)。

注：分別以150 μg 的Ia、Ib可溶性蛋白以及150 μg的Ia與Ib等量混合蛋白先進(jìn)行2D電泳后再進(jìn)行銀染，然后與2D-DIGE電泳圖進(jìn)行比對(duì)，找出相對(duì)應(yīng)的表達(dá)差異蛋白點(diǎn)Note:150 μg Ia and Ib soluble protein is added into 150 μg equal volume of Ia and Ib mixture for master gel 2D electrophoresis. The 2D protein gel is stained with sliver, and then compared with 2D-DIGE gel to find out the differential expression protein spots on the master gel圖3　Master膠 2D電泳結(jié)果Fig.3　Master gel 2D electrophoresis

圖4　差異蛋白生物學(xué)過(guò)程的Gene ontology分析Fig.4　Biological process analysis of different proteins by Gene ontology

3討論

3.1Ia和Ib血清型無(wú)乳鏈球菌表達(dá)差異蛋白

圖5　差異蛋白的Pathway分析Fig.5　Pathway analysis of different proteins

目前,羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病還沒(méi)有有效的治療藥物。疫苗接種被認(rèn)為是最有效的防控手段，但由于無(wú)乳鏈球菌存在很多種血清型[4,6-9]，而且不同血清型鏈球菌疫苗之間缺乏有效的交叉保護(hù)力[4]，這就阻礙了無(wú)乳鏈球菌病疫苗的研發(fā)，因此，揭示無(wú)乳鏈球菌不同血清型免疫原性存在差異的原因，對(duì)未來(lái)疫苗的研發(fā)有一定的指導(dǎo)作用。本研究中，應(yīng)用2D-DIGE電泳技術(shù)分析羅非魚(yú)Ia和Ib血清型無(wú)乳鏈球菌的表達(dá)差異蛋白，并用MALDI-TOF-MS鑒定了這些蛋白。蛋白雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)是一種新型的蛋白組分析技術(shù), 它將統(tǒng)計(jì)學(xué)可信的蛋白組差異數(shù)據(jù)和2D的高分辨率完美結(jié)合，既保留了2D蛋白電泳的敏感性，又加入了新出現(xiàn)的熒光標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)，可以在同一塊膠中分析不同樣品的蛋白表達(dá)。此外，由于引入了內(nèi)標(biāo)，顯著減少了膠間差異和工作量，明顯提高了檢測(cè)差異蛋白的靈敏度、準(zhǔn)確率和可重復(fù)性[10-11]。在動(dòng)物醫(yī)學(xué)方面，2D-DIGE 技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于不同類(lèi)型, 不同個(gè)體的細(xì)胞、組織，或經(jīng)過(guò)不同處理和不同生長(zhǎng)條件下蛋白表達(dá)差異的分析[12-16]。

本試驗(yàn)中，應(yīng)用DeCyder 2D差異分析軟件全自動(dòng)對(duì)一塊膠內(nèi)的多個(gè)樣品進(jìn)行掃描分析，并全自動(dòng)進(jìn)行匹配，得到蛋白豐度的準(zhǔn)確變化。根據(jù)P≤0.05和蛋白表達(dá)差異倍數(shù)1.5倍以上的差異點(diǎn)判定條件，判定出表達(dá)差異蛋白。經(jīng)掃描分析，Ia和Ib血清型無(wú)乳鏈球菌存在167個(gè)蛋白表達(dá)差異蛋白點(diǎn)，相對(duì)于Ia血清型菌株，Ib血清菌株有74個(gè)上調(diào)蛋白點(diǎn)，93個(gè)下調(diào)蛋白點(diǎn)。表達(dá)差異倍數(shù)>10以上的有14個(gè)蛋白點(diǎn)；5~10倍的有10個(gè)蛋白點(diǎn)；1~5倍的有143個(gè)蛋白點(diǎn)。這說(shuō)明Ia和Ib血清型無(wú)乳鏈球菌的可溶性蛋白存在較大差異。

3.2差異表達(dá)蛋白的鑒定和分析

在獲得的167個(gè)差異蛋白點(diǎn)中，共鑒定獲得了32種不同的蛋白，其中部分蛋白點(diǎn)由于濃度太低未能檢測(cè)到，還有部分差異蛋白點(diǎn)編碼相同的蛋白。其中相對(duì)Ia血清型，Ib型菌株在32個(gè)鑒定的蛋白點(diǎn)中，只有8個(gè)上調(diào)蛋白，其他24個(gè)為下調(diào)蛋白；表達(dá)差異倍數(shù)>10以上的有2個(gè)蛋白；5~10倍的有3個(gè)蛋白；1~5倍的有27個(gè)蛋白(表1)。

在這32種差異表達(dá)蛋白中，大部分為酶類(lèi)，如氧化還原酶、合成酶和轉(zhuǎn)移酶。Gene ontology分析和KEGG Pathway通路分析表明，32種差異蛋白涉及12種生物學(xué)過(guò)程和6個(gè)通路代謝。對(duì)這些蛋白的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)部分酶可能與細(xì)菌免疫反應(yīng)有關(guān)，如GAPGH、半胱氨酸合成酶和錳依賴性錳超氧化物歧化酶。研究表明，GAPGH能夠與纖維蛋白酶原結(jié)合蛋白，是一種保護(hù)性抗原，可用于疫苗的研發(fā)[17]，另外該蛋白能夠誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答對(duì)抗牛支原體的感染[18]。此外還發(fā)現(xiàn)，GAPDH作為鏈球菌血纖維蛋白溶酶的受體參與黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主[19-20]。鏈球菌的半胱氨酸合成酶有兩種類(lèi)型：O-乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶-A(cysK)和O-乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶-B(cysM)[21]。研究證實(shí)，免疫重組的cysK能夠產(chǎn)生高滴度的IgG1和IFN-γ，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)，并在對(duì)抗布魯氏菌感染中起到一定的保護(hù)作用[22]。錳依賴性的錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)是金屬酶催化過(guò)氧化氫和分子氧轉(zhuǎn)化的超分子，在一些細(xì)胞系中Mn-SOD作為一種救援蛋白對(duì)抗TNFα的細(xì)胞毒性[23]。此外，Mn-SOD已被證明參與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]。這些與免疫和疫苗相關(guān)的差異表達(dá)蛋白是否與Ia和Ib血清型無(wú)乳鏈球菌的免疫原性相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Chen M,Li L P,Wang R,et al.PCR detection and pfge genotype analyses of streptococcal clinical isolates from tilapia in China[J].Veterinary Microbiology,2012,159(3/4):526-530.

[2]Hughes M J G,Moore J C,Lane J D,et al.Identification of major outer surface proteins ofStreptococcusagalactiae[J].Infection and Immunity,2002,70(3):1254-1259.

[3]Shin G W,Palaksha K J,Yang H H,et al.Partial two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) maps ofStreptococcusiniaeATCC29178 andLactococcusgarvieaeKG9408[J].Diseases of Aquatic Organisms,2006,70(1):71-79.

[4]Chen M,Wang R,Li L P,et al.Screening vaccine candidate strains againstStreptococcusagalactiaeof tilapia based on PFGE genotype[J].Vaccine,2012,30：6088-6092.

[5]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72(1):248-254.

[6]Pressey J G,Pressey C S,Robinson G,et al.2D-difference gel electrophoretic proteomic analysis of a cell culture model of alveolar rhabdomyosarcoma[J].Journal of Proteome Research,2011,10:624-636.

[7]Evans J J,Bohnsack J F,Klesius P H,et al.Phylogenetic relationships amongStreptococcusagalactiaeisolated from piscine,dolphin,bovine and human sources:a dolphin and piscine lineage associated with a fish epidemic in Kuwait is also associated with human neonatal infections in Japan[J].Journal of Medical Microbiology,2008,57:1369-1376.

[8]Suanyuk N,Kong F,Ko D,et al.Occurrence of rare genotypes ofStreptococcusagalactiaein cultured red tilapiaOreochromissp.and Nile tilapiaO.niloticusin Thailand—relationship to human isolates[J].Aquaculture,2008,284(1/4):35-40.

[9]Ye X,Li J,Lu M X,et al.Identification and molecular typing ofStreptococcusagalactiaeisolated from pond-cultured tilapia in China[J].Fish Science,2011,77:623-632.

[10]Uenlue M,Morgan M E,Minden J S.Difference gel electrophores is:a single method for detecting changes in protein extracts[J].Electrophoresis,1997,18:2071-2077.

[11]Tonge R,Shaw J,Middleton B,et al.Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology[J].Proteomics,2001,1(3):377-396.

[12]Langereis J D,Prinsen B H,de Sain-van der Velden M G,et al.A 2D-DIGE approach to identify proteins involved in inside-out control of integrins[J].Journal of Proteome Research,2009,8(8):3824-3833.

[14]Briolant S,Almeras L,Belghazi M,et al.ResearchPlasmodiumfalciparumproteome changes in response to doxycycline treatment[J].Malaria Journal,2010,9:141.

[15]王箏揚(yáng).肺癌與炎癥性胸腔積液蛋白質(zhì)熒光差異雙向電泳圖譜分析[D].杭州：浙江大學(xué),2008.

[16]Douette P,Navet R,Gerkens P.Steatosis-induced proteomic changes in liver mitochondria evidenced by two-dmiensional differential in-gel electrophoresis[J].Proteomics,2005,4:2024-2031.

[17]Rosinha G M S,Myioshi A,Azevedo V,et al.Molecular and immunological characterisation of recombinantBrucellaabortusglyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase,a T-and B-cell reactive protein that induces partial protection when co-administered with an interleukin-12-expressing plasmid in a DNA vaccine formulation[J].Journal of Medical Microbiology,2002,51(8):661-671.

[18]Perez-Casal J,Prysliak T.Detection of antibodies against theMycoplasmabovisglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase protein in beef cattle[J].Microbial Pathogenesis,2007,43(5):189-197.

[19]Bisno A L,Brito M O,Collins C M.Molecular basis of group A streptococcal virulence[J].The Lancet Infectious Diseases,2003,3(4):191-200.

[20]Cunningham M W.Pathogenesis of group A streptococcal infections[J].Clinical Microbiology Reviews,2000,13(3):470-511.

[21]Kredich N M. Biosynthesis of cysteine[M]//Neidehardt F C,Curtiss III R,Ingraham J L,et al.EscherichiacoliandSalmonellacellular and molecular biology.2nd ed.Washington,D.C.:ASM Press,1996: 514-527.

[22]Jain S,Afley P,Kumar S.Immunological responses to recombinant cysteine synthase A ofBrucellaabortusin BALB/c mice[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2013,29(5):907-913.

[23]Kawaguchi T,Takeyasu A,Matsunobu K,et al.Stimulation of Mn-superoxide dismutase expression by tumor necrosis factor-α:quantitative determination of Mn-SOD protein levels in TNF-resistant and sensitive cells by ELISA[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1990,171(3):1378-1386.

[24]Yesilkaya H,Kadioglu A,Gingles N,et al.Role of manganese-containing superoxide dismutase in oxidative stress and virulence ofStreptococcuspneumonia[J].Infection and Immunity,2000,68(5):2819-2826.

Comparison of soluble protein between Ia and Ib serotypes of

Streptococcusagalactiaestrains from tilapiaOreochromisniloticus

SHI Yun-liang1,2,3,LI Li-ping1, WANG Rui1, LIANG Wan-wen1, GAN Xi1, HUANG Ting1,

LI Jian2,3, HUANG Wei-yi2,3, CHEN Ming1

(1.Guangxi Key Laboratory for Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture, Guangxi Institute of Fisheries, Nanning 530021, China；2.College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China；3.Center for Food Safety and Quality，Guangxi University, Nanning 530005, China)

Abstract：Our previous study showed that there was no cross protection in vaccines prepared from Streptococcus agalactiaestrains with different serotypes (Ia and Ib) isolated from Nile tilapia Oreochromis niloticus. Soluble protein of Ia and Ib serotypes S.agalactiae strains were extracted, isolated and analyzed using two dimension-Difference Gel Electrophoresis (2D-DIGE) and the differential expression protein spots and the differential expression proteins were identified by MALDI-TOF-MS in order to understanding of the reason for the immunogenicity difference between Ia and Ib serotypes tilapia S.agalactiae. The functional category of the identified protein was determined by DAVID bioinformatics database. The results showed that there were 167 differential expression protein spots between these two serotypes strains in the 2D-DIGE gel and 32 proteins were identified by MALDI-TOF-MS. Most of the identified proteins were involved in related biological processes including oxidation-reduction, generation of precursor metabolites and energy and glucose metabolic process, especially involved in glycolysis/gluconeogenesis, pyruvate metabolism and fatty acid biosynthesis pathways. Protein function prediction indicated that GAPGH, cysteine synthase and manganese-dependent superoxide dismutase were associated with immunity and vaccine developing. The findings firstly approve that there are lots of differential expression proteins between Ia and Ib serotypes of S.agalactiae strains, some of which are immune-related proteins and (or) vaccine-related proteins, which is contributed to the immunogenicity different between Ia and Ib serotypes of S.agalactiae strains, but still need further research.

Key words：Oreochromis niloticus; Streptococcus agalactiae; Ia and Ib serotype; soluble protein; two dimension-Difference Gel Electrophoresis (2D-DIGE); differential analysis

通信作者：陳明(1981—)， 男， 副研究員，博士。E-mail:cm990919@163.com

作者簡(jiǎn)介：石云良(1982—)， 男， 博士研究生。E-mail:syunliang2008@126.com

基金項(xiàng)目：廣西科技發(fā)展“十二五”規(guī)劃重大專項(xiàng)(14121004-2-4)；廣西壯族自治區(qū)“八桂學(xué)者”崗位專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(BGXZ-LFY-04)；廣西羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)崗位科研經(jīng)費(fèi)(GXBY-03)；廣西自治區(qū)直屬公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(GXIF-2014-010)；廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(GXKL-AQUA-2013-C-02)

收稿日期：2014-06-27

中圖分類(lèi)號(hào)：Q954.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-1388(2015)02-0125-07

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.003