黃炬輝

?實驗研究?

苦瓜子有效成分RNA酶MC2抑制肝癌細胞生長的作用分析

黃炬輝

目的 對苦瓜子有效成分RNA酶(RNase)MC2抑制肝癌細胞生長的作用和機制進行分析和探討。方法 通過克隆形成和MTT對肝癌細胞增殖受到的RNase MC2的影響進行分析；選擇流式細胞技術(shù)對肝癌細胞周期受到的RNase MC2的影響進行檢測；選擇電鏡對細胞自噬受到的RNase MC2的誘導(dǎo)作用進行檢測。結(jié)果 RNase MC2會對肝癌細胞增殖起到顯著的抑制作用；通過對p21和p53蛋白表達進行上調(diào)能夠?qū)е翯2/M期阻滯；通過LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達的增加能夠?qū)毎允善鸬秸T導(dǎo)作用。結(jié)論 RNase MC2通過對p21的上調(diào)能夠?qū)2/ M 期阻滯起到誘導(dǎo)作用,通過對Beclin-1的上調(diào)能夠?qū)毎允善鸬秸T導(dǎo)作用,從而對肝癌細胞中的增殖起到顯著的抑制作用。

RNA酶MC2；肝癌細胞；抑制

在全球范圍內(nèi)肝癌細胞都屬于一種常見的惡性細胞,因此肝癌細胞治療技術(shù)的進展受到了人們的普遍關(guān)注。肝癌細胞的抗藥性非常強,其具有很高的死亡率?，F(xiàn)階段肝癌細胞的治療技術(shù)仍然沒有實現(xiàn)突破性進展,大量的研究表明［1］,治療肝癌細胞的一個非常重要的途徑就是提取中草藥中的有效成分,對其中的抗腫瘤藥物進行篩選。作為一種核糖核酸酶,RNase C2屬于一種飲食苦瓜子提取物,其能夠?qū)Ω伟┘毎纳L起到抑制作用。本文對苦瓜子有效成分RNase MC2抑制肝癌細胞生長的作用和機制進行了分析和探討,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 從美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)購買el-7402和QGY-7703人類肝癌細胞株,由本院提供RNase MC2,通過純水溶解RNase MC2,使其成為5.0mmol/L儲存液的形式。

1.2 方法 ①細胞培養(yǎng)：在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)el-7402(為對照)和QGY-7703人類肝癌細胞株,具體培養(yǎng)條件為：選

擇10%胎牛血清的DMEM作為培養(yǎng)基；溫度為37℃；濕度為95%；CO2濃度為5%［2］。②通過MTT法測定細胞活性。在96孔板中對8000個細胞進行24 h的培養(yǎng),隨后將濃度分別為20、5、1 μmol/L的RNase MC2加入進去,進行48 h的孵育。將100ml的MTT溶液分別加入到每孔中,使其持續(xù)2.5 h的作用［3］。在將上清液去除掉后,將100ml的二甲亞砜(DMSO)溶液加入,利用分光光度計對充分溶解后的晶體進行讀取。③克隆形成實驗：在6孔板中對100個細胞進行培養(yǎng),隨后在5.0 μmol/L RNase MC2的培養(yǎng)基中將其加入。選擇0.05%結(jié)晶紫對其進行5min的染色,對集落數(shù)量進行計算［4］。④細胞周期檢測：在細胞受RNase MC2作用不同時間后,通過70%的乙醇將其固定在4℃冰箱中過夜,將磷酸鹽緩沖溶液(PBS)加入,在黑暗中對其進行30min的放置。通過流式細胞儀對不同細胞周期的細胞數(shù)量進行檢測［5］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNase MC2對肝癌細胞增殖的抑制作用 濃度在2.5 μmol/L以上的RNase MC2能夠使肝癌細胞活性為60%以下,對肝癌細胞的活性起到顯著的抑制作用,2.5 μmol/L以下的RNase MC則具有抑制80%以上的肝癌細胞活性, 比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。克隆形成結(jié)果顯示,RNase MC2能夠使肝癌細胞的克隆形成能力出現(xiàn)明顯下降。

2.2 RNase MC2對G2/M期阻滯的誘導(dǎo)作用 通過流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示,肝癌細胞在受到RNase MC2作用的24 h之后,其出現(xiàn)了G2/M期阻滯。如其中的2.5 μmol/L,Bel-7402在G2/M期達到了(36.95±5.26)%的細胞百分比,QGY-7703在G2/M期達到了(30.25±3.72)%的細胞百分比；對照細胞則分別達到了(23.50±3.63)%和(17.74±4.62)%的細胞數(shù)量百分比,比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 RNase MC2對肝癌細胞自噬的誘導(dǎo)作用 通過四甲吖啶進行染色,對RNase MC2產(chǎn)生的對細胞質(zhì)內(nèi)酸性自噬泡的誘導(dǎo)作用進行進一步觀察。結(jié)果顯示,肝癌細胞在經(jīng)過RNase MC2處理后出現(xiàn)了明顯增多的細胞質(zhì)內(nèi)酸性自噬泡數(shù)量。電鏡結(jié)果顯示,肝癌細胞在經(jīng)過RNase MC2處理后形成了多個自噬小體。此外,上調(diào)的LC3-Ⅱ和Beclin-1表達對發(fā)生細胞自噬具有提示作用。

3 討論

通過中藥能夠使化療藥物的副作用得以有效減輕,使腫瘤患者的生活質(zhì)量得以改善,并且增加腫瘤患者的生存期。所以提取中藥中的有效成分,使其對肝癌細胞進行對抗,是突破肝癌細胞治療瓶頸的一種非常重要的方式［6］。本次研究發(fā)現(xiàn),RNase MC2作為苦瓜子的有效提取成分,可以對肝癌細胞的增殖起到顯著地抑制作用,RNase MC2通過對p21的上調(diào)能夠?qū)2/ M期阻滯起到誘導(dǎo)作用,通過對Beclin-1的上調(diào)能夠?qū)毎允善鸬秸T導(dǎo)作用,其主要是對肝癌細胞中的Bel-7402和QGY-7703的表達進行誘導(dǎo),從而進一步誘發(fā)出現(xiàn)G2/ M 期阻滯。

在病理狀態(tài)細胞和正常細胞中自噬屬于一種普遍存在的生理機制,在細胞的生理和病理過程中自噬具有十分重要的作用,特別是在癌細胞中作為細胞代謝壓力的適應(yīng)性反應(yīng)自噬發(fā)揮了十分重要的作用［7］。本次研究表現(xiàn),RNase MC2通過對Beclin-1的上調(diào)能夠?qū)毎允善鸬秸T導(dǎo)作用。但是目前尚未清楚在RNase MC2誘發(fā)細胞死亡中自噬的作用機制,仍然需要對其作用機制進行更深一步的研究［8］。

綜上所述,本次研究顯示RNase MC2通過對p21的上調(diào)能夠?qū)2/ M 期阻滯起到誘導(dǎo)作用,通過對Beclin-1的上調(diào)能夠?qū)毎允善鸬秸T導(dǎo)作用,從而對肝癌細胞中的增殖起到顯著地抑制作用。因此表明,RNase MC2作為苦瓜子的有效提取成分,屬于一種具有開發(fā)價值的抗腫瘤藥物。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.11.203

2016-03-09］

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