潘偉 郝文婷 李向陽 徐慧雯 孫芬芬

·實(shí)驗(yàn)研究·

多烯磷脂酰膽堿對(duì)樹突狀細(xì)胞的抑制作用研究

潘偉 郝文婷 李向陽 徐慧雯 孫芬芬

目的研究多烯磷脂酰膽堿(PPC)對(duì)樹突狀細(xì)胞(DC)表型分化及分泌炎癥因子的影響,探討PPC抗炎作用。方法8只SPF紋雌性Balb/c小鼠,隨機(jī)分為四組,每組2只。運(yùn)用免疫磁珠分析小鼠脾臟DC,分別加入PPC(PPC組,2只)、脂多糖(LPS,LPS組,2只)、PPC+LPS(PPC+LPS組,2只)以及磷酸鹽緩沖液(PBS,PBS組,2只)進(jìn)行刺激。24 h后收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清,流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面活化分子表達(dá)情況,流式微珠陣列法(CBA)檢測細(xì)胞因子分泌情況。結(jié)果PPC組DC表面CD40、CD80、CD86、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-Ⅱ分別為(23.43±2.79)%、(19.41±1.33)%、(44.30±3.16)%、(80.87±1.32)%,低于PBS組的(29.10±8.14)%、(31.81±1.02)%、(47.70±6.32)%、(83.17±2.84)%；且顯著低于LPS組的(42.33±0.58)%、(63.57±2.61)%、(56.07±0.06)%、(86.20±0.95)%(P<0.01)；PPC+LPS組CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分別為(16.73±3.14)%、(16.12±1.92)%、(43.60±0.95)%、(78.83±1.46)%,顯著低于LPS組(P<0.01)。PPC組和PPC+LPS組白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)顯著低于LPS組(P<0.01)。PPC+LPS組單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)水平明顯低于LPS組(P<0.01)。結(jié)論P(yáng)PC可通過抑制DC活化及炎癥因子釋放,發(fā)揮抗炎效果。

多烯磷脂酰膽堿；樹突狀細(xì)胞；細(xì)胞表型；炎癥因子

磷脂酰膽堿(PC)又稱為卵磷脂,由磷脂?；c膽堿的羥基酯化形成,具有護(hù)肝［1,2］、健腦、美容等功效。近年來發(fā)現(xiàn)其對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用已在腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［1］模型中證實(shí),PC可以抑制TNF-α、IL-6等促炎因子釋放,促進(jìn)IL-10等抗炎因子分泌,從而緩解病情。DC是目前已知的最有效的專職抗原提呈細(xì)胞,貫穿于炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程中。成熟的DC表達(dá)高水平MHC-Ⅱ以及協(xié)同刺激分子,可分泌多種細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分化；也可將抗原遞呈給T細(xì)胞并使之活化,啟動(dòng)機(jī)體的初次免疫應(yīng)答。那么PC是否通過抑制DC成熟以及炎癥因子釋放,下調(diào)機(jī)體炎癥反應(yīng),目前尚不清楚。本文以PC衍生物——PPC為研究對(duì)象,明確其對(duì)DC的體外抑制作用,為闡明PC的抗炎機(jī)制提供見解。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠8只,體重18～22 g,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司。8只小鼠隨機(jī)分為四組,每組2只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 青霉素、鏈霉素為美國GIBCO公司產(chǎn)品；PPC注射液購自賽諾菲安萬特(北京)制藥有限公司；Mouse inflammation kit及 Cytometric bead array mouse/rat soluble protein master buffer kit,為美國BD公司產(chǎn)品；抗小鼠 FITC-CD11c、PerCP-Cy5.5-CD80、PE-Cy7-CD86、PECD40、APC-MHC-Ⅱ及其同型對(duì)照,流式染色緩沖液,為美國eBioscience公司產(chǎn)品；Mouse CD11c microbeads,為德國Miltenyi公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 離心機(jī)購自德國Eppendorf公司及美國Beckman公司；FACSCanto Ⅱ流式儀及FCAP 3.0軟件購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 DC分離及刺激 剖殺Balb/c小鼠,無菌取脾臟,制備單細(xì)胞懸液,采用CD11c分離試劑盒陽性分選DC細(xì)胞,流式細(xì)胞儀鑒定其純度為90%以上。以1×106cells/ml的濃度鋪于24孔板,分別加入1 μg/ml LPS(LPS組,2只),20 μg/ml PPC(PPC組,2只),1 μg/ml LPS+20 μg/ml PPC(PPC+LPS組,2只),同時(shí)設(shè)等體積PBS為陰性對(duì)照的PBS組(2只)。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,收集上清及細(xì)胞沉淀,備用。

1.2.2 DC表型測定 用PBS重懸細(xì)胞沉淀,加入流式管,每管200 μl,混勻后,分別加入CD11c-FITC/CD40-PE/CD80-PerCP-Cy5.5/CD86-PE-Cy7/MHC-Ⅱ-APC抗體,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照及單標(biāo)管。避光室溫反應(yīng)30 min后,用流式染色緩沖液洗滌1次,每管各加入100 μl流式染色緩沖液重懸細(xì)胞,用FACSCanto Ⅱ流式儀進(jìn)行上機(jī)檢測,FlowJo 7.6.1軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 細(xì)胞因子檢測 采用小鼠炎癥因子檢測試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、TNF、MCP-1、IL-12p70、IL-10的水平。具體標(biāo)記方法參照說明書。將標(biāo)記好的樣本用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,利用FCAP 3.0軟件進(jìn)行細(xì)胞因子濃度的換算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPC對(duì)DC表型分化的影響 PPC組DC表面CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分別為(23.43±2.79)%、(19.41±1.33)%、(44.30±3.16)%、(80.87±1.32)%,低于PBS組的(29.10±8.14)%、(31.81±1.02)%、(47.70±6.32)%、(83.17±2.84)%；且顯著低于LPS組的(42.33±0.58)%、(63.57±2.61)%、(56.07±0.06)%、(86.20±0.95)%(P<0.01)。PPC+LPS組 CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分別為(16.73±3.14)%、(16.12±1.92)%、(43.60±0.95)%、(78.83±1.46)%,顯著低于LPS組(P<0.01)。

2.2 PPC對(duì)DC分泌炎癥因子的影響 PPC組培養(yǎng)上清中IL-6、TNF的含量分別為(4.27±0.57)、(123.18±8.82)pg/ml,與PBS組的(9.44±4.06)、(139.35±45.87)pg/ml比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但顯著低于LPS組的(48.23±7.85)、(471.40±61.07)pg/ml(P<0.01)。PPC+LPS組IL-6、TNF水 平分別為(4.32±0.93)、(121.47±13.37)pg/ml,顯著低于LPS組(P<0.01)。PBS組、PPC組和LPS組的MCP-1水平分別為(18.13±1.38)、(22.51±10.47)、(19.86±2.15)pg/ml,三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而PPC+LPS組的MCP-1水平為(11.43±1.51)pg/ml,明顯低于LPS組(P<0.01)。

3 討論

本研究利用體外模型探討了PPC對(duì)DC的抑制作用,發(fā)現(xiàn)PPC可下調(diào)DC表面CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子的表達(dá),抑制IL-6、TNF等炎癥因子分泌,并能抑制LPS誘導(dǎo)的DC活化及炎癥反應(yīng),提示PPC可通過作用于DC發(fā)揮抗炎效應(yīng)。

PPC是一種臨床療效較為肯定的護(hù)肝藥［1］,含有PC和大量不飽和脂肪酸。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性磷脂一致,可直接影響膜結(jié)構(gòu),使受損肝功和酶活恢復(fù)正常；也可調(diào)節(jié)肝臟能量平衡,將中性脂肪和膽固醇轉(zhuǎn)化成容易代謝的形式,從而發(fā)揮護(hù)肝作用。本研究發(fā)現(xiàn)PPC可通過作用于DC誘導(dǎo)抗炎作用,可為進(jìn)一步開發(fā)PPC作為抗炎藥物奠定基礎(chǔ)。

［1］胡國平,劉凱,王甦,等.多烯磷脂酰膽堿(易善復(fù))治療慢性肝炎的系統(tǒng)評(píng)價(jià).中國循證醫(yī)學(xué)雜志,2005,5(7):543-548.

［2］張民杰,楊敏,張宗權(quán).易善復(fù)治療黃褐斑療效分析與評(píng)價(jià).臨床合理用藥雜志,2011,4(5C):51-52.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.24.125

2016-10-25］

江蘇省教育廳高校自然科學(xué)研究基金面上項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：15KJB310025)；江蘇省博士后科研資助計(jì)劃(項(xiàng)目編號(hào)：1501061A)；徐州醫(yī)學(xué)院優(yōu)秀人才啟動(dòng)基金(項(xiàng)目編號(hào)：D2015004)

221004 徐州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室、感染與免疫實(shí)驗(yàn)室(潘偉 郝文婷 李向陽徐慧雯)；形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心(孫芬芬)

孫芬芬