王俊貴州省食品藥品檢驗所，貴州　貴陽　550004

活血止痛貼微生物限度檢查方法驗證

王俊
貴州省食品藥品檢驗所，貴州貴陽550004

【摘要】目的:建立活血止痛貼微生物限度檢查方法.方法:按照2010版《中國藥典》一部的微生物限度檢查法，采用常規(guī)平皿法和平皿稀釋法對各試驗菌的回收率逐一進行驗證;采用常規(guī)法和稀釋法進行控制菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的方法驗證.結果:大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌采用平皿稀釋法時，回收率均高于70%;白色念珠菌、黑曲霉采用常規(guī)平皿法時回收率均高于70%，采用稀釋法檢查控制菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌時實驗組檢出實驗菌.結論:活血止痛貼細菌計數(shù)采用平皿稀釋法檢查，霉菌和酵母菌計數(shù)采用常規(guī)平皿法檢查，控制菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌采用稀釋法檢查，方法經(jīng)驗證有效，可用于此藥品的微生物限度檢查，能有效控制藥品質量，準確可靠.

【關鍵詞】活血止痛貼;微生物限度檢查法;稀釋法

Microbial limit examination method validation of invigorate the circulation of analgesic paste

WANG jun
Guizhou province food and drug inspection，Guiyang 550004，China

Abstract:Objective To establish microbial limit inspection method of invigorate the circulation of analgesic paste．Methods According to Chinese pharmacopoeia 2010 version of the microbial limit test，verify the recovery of each test bacteria individually using the conventional plate method and plate dilution method; method validation to control bacteria Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus using the conventional method and dilution method．Results When Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis using plate dilution method，recoveries were higher than 70%; Recoveries were higher than 70% when Candida albicans and Aspergillus niger using conventional plate method，detected bacteria in the experimental group when checking control bacteria Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus using dilution method．Conclusion Bacteria count of invigorate the circulation of analgesic paste to check by plate dilution method，mold and yeast count to check by the conventional plate method，control bacteria Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus to check by the dilution method，the method validated，available for microbial limit test to this medicines，can effectively control drug quality，accurate and reliable．

Key words:invigorate the circulation of analgesic paste; Microbial limit test; Dilution method．

1　實驗材料

1. 1供試品活血止痛貼(批號: 140401、140402、140403，貴州心意藥業(yè)有限責任公司)，規(guī)格: 2. 3g/貼，9 貼/盒.

1. 2儀器高壓蒸汽滅菌器、凈化操作間、凈化工作臺、生物安全柜、振蕩器、電熱恒溫水浴箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱.1. 3培養(yǎng)基pH 7. 0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、溴化16烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(均由北京陸橋技術有限責任公司生產(chǎn)) .

1. 4菌種大腸埃希菌( Escherichia coli)[CMCC ( B) 44102]第3代;金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) [CMCC ( B) 26003]第3代;枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)[CMCC ( B) 63501]第3代;白色念珠菌( Candida albicans)[CMCC ( F) 98001]第3代;黑曲霉( Aspergillus niger)[CMCC ( F) 98003]第3代;銅綠假單孢菌( Pseudomonas aeruginosa)[CMCC ( B) 10104]第3代.

2　方法與結果

2. 1菌液制備方法接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，分別取上述培養(yǎng)物1ml，加0. 9%的無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)24～48h，取培養(yǎng)物1ml，加0. 9%無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液;接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，置23 ～28℃培養(yǎng)5～7d，加入5ml含0. 05% ( ml/ml)聚山梨酯80的0. 9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫.吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi).取原液1ml，加含0. 05% ( ml/ml)聚山梨酯80的0. 9%無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成每1ml含孢子數(shù)為50～100cfu的孢子懸液.

2. 2供試液制備按2010年版《中國藥典》一部附錄微生物限度檢查法之規(guī)定，取供試品100cm2，放置于無菌紙上，粘貼面朝上，用無菌紗布覆蓋貼膏劑的粘貼面，然后用無菌剪刀剪碎，置500ml無菌的含玻璃珠的三角瓶中，加30ml的十四烷基酸異丙酯，45℃保溫振搖至供試品分散均勻，加pH 7. 0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至200ml，充分振搖，將部分油脂倒出，將剩余萃取液倒入無菌的分液漏斗中待油水明顯分層，萃取，用三角燒瓶收集水層作為1 ∶20供試液，備用.

2. 3菌落計數(shù)方法的驗證

2. 3. 1試驗組取1∶20供試液分1、0. 5、0. 2ml和含50 ～100cfu的試驗菌液(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)，分別注入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、

枯草芽孢桿菌)和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(白色念珠菌和黑曲霉)，每株試驗菌平行制備2個平皿，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌置30～35℃培養(yǎng)3d，白色念珠菌和黑曲霉置23～28℃培養(yǎng)5d，測定其菌數(shù).

2. 3. 2菌液組分別吸取含50～100cfu的試驗菌液(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)，注入滅菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(白色念珠菌和黑曲霉)每株試驗菌平行制備2個平皿，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌置30～35℃培養(yǎng)3d，白色念珠菌和黑曲霉置23～28℃培養(yǎng)5d，測定其菌數(shù).

2. 3. 3供試品對照組取1∶20供試液分1、0. 5、0. 2ml分別注入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，細菌計數(shù)和霉菌及酵母菌計數(shù)分別平行制備2個平皿，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置30～35℃培養(yǎng)3d，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置23～28℃培養(yǎng)5d，測定其菌數(shù).

2. 3. 4回收率計算各試驗菌株的回收率= (實驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù))÷菌液組平均菌落數(shù)×100%，結果見表1－3.

表1　1ml/皿細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證測定結果( %)

由表1、表2、表3的結果可知，平皿稀釋法試驗大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3株菌株回收率均能達到70%以上，常規(guī)平皿法試驗白色念珠菌、黑曲霉2株菌株回收率均能達到70%以上，說明平皿稀釋法法可用于活血止痛貼的細菌計數(shù)，常規(guī)平皿法可用于活血止痛貼的霉菌及酵母菌計數(shù).

2. 4控制菌檢查方法的驗證

2. 4. 1金黃色葡萄球菌檢查方法的驗證

2. 4. 1. 1試驗組分別取1∶20的供試液各20ml及含50～100cfu金黃色葡萄球菌菌液，分別接種至100、200ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，34℃培養(yǎng)24h，可見100ml培養(yǎng)基不混濁，200ml培養(yǎng)基混濁，取上述兩種培養(yǎng)物，劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24h，可見100ml的無菌生長，200ml的有菌落生長，呈金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有黃色環(huán).

表2　0. 5ml/皿細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證測定結果( %)

表3　0. 2ml/皿細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證測定結果( %)

2. 4. 1. 2陰性菌對照組取1∶20的供試液20ml及含50～100cfu大腸埃希菌菌液，接種至200ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，34℃培養(yǎng)24h.取上述培養(yǎng)物，劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24h，平板上無菌生長.

2. 4. 1. 3驗證結果上述方法試驗組100ml未檢出金黃色葡萄球菌，200ml檢出了金黃色葡萄球菌，陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌.說明稀釋法200ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基可以用于退熱貼金黃色葡萄球菌的檢查.結果見表4.

表4　控制菌金黃色葡萄球菌驗證結果

2. 4. 2銅綠假單胞菌檢查方法的驗證

2. 4. 2. 1試驗組分別取1∶20的供試液各20ml及含50～100cfu銅綠假單胞菌菌液，分別接種至100、200ml的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基內(nèi)，34℃培養(yǎng)24h，可見100ml培養(yǎng)基不混濁，200ml培養(yǎng)基混濁，有菌膜生長，取上述兩種培養(yǎng)物，劃線接種至溴化16烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24h，可見100ml的無菌生長，200ml的有菌落生長，呈灰白色，扁平、無定形、周邊有擴散現(xiàn)象，表面濕潤，菌落周圍有水溶性藍綠色素擴散，使培養(yǎng)基顯藍綠色.

2.4.2.2陰性菌對照組取1∶20的供試液20ml及含50～100cfu大腸埃希菌菌液，接種至200ml的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基內(nèi)，34℃培養(yǎng)24h.取上述培養(yǎng)物，劃線接種至溴化16烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24h，平板上無菌生長.

2. 4. 2. 3驗證結果上述方法試驗組100ml未檢出銅綠假單胞菌，200ml檢出了銅綠假單胞菌，陰性菌對照組未檢出銅綠假單胞菌.說明稀釋法200ml膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基可以用于活血止痛貼銅綠假單胞菌的檢查.結果見表5.

表5　控制菌銅綠假單胞菌驗證結果

3　結論

綜上所述，活血止痛貼細菌計數(shù)采用平皿稀釋法檢查，霉菌和酵母菌計數(shù)采用常規(guī)平皿法檢查，控制菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌采用稀釋法檢查，方法經(jīng)驗證有效，可用于此藥品的微生物限度檢查，能有效控制藥品質量，準確可靠.

參考文獻

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 79－88．

[2]中國藥品生物制品檢定所．中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 351－407．

收稿日期:( 2014. 11. 29)

【文章編號】1007－8517 ( 2015) 04－0014－03

【文獻標志碼】A

【中圖分類號】R927. 11