姚　欣林靜瑜倪　峰張月芬.福建中醫(yī)藥大學，福建　福州　50; .福建省中醫(yī)藥研究院，福建　福州　5000; .福建衛(wèi)生職業(yè)技術學院，福建　福州　500

藤茶提取物對人前列腺癌LNcap細胞凋亡作用研究

姚欣1林靜瑜2倪峰3張月芬3
1.福建中醫(yī)藥大學，福建福州350122; 2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建福州350003; 3.福建衛(wèi)生職業(yè)技術學院，福建福州350101

【摘要】目的:研究藤茶提取物對人前列腺癌LNcap細胞凋亡的作用.方法:用流式Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡率.結果:藤茶提取物對LNcap細胞作用24h后，細胞凋亡率顯著增加，且有量效關系.結論:藤茶提取物可顯著誘導LNcap細胞凋亡.

【關鍵詞】藤茶;前列腺癌; LNcap;細胞凋亡

Research on Apoptosis of LNcap Cells with the Extract of Ampelopsis

YAO Xin1LIN Jing－yu2NI Feng3ZHANG Yue－fen3
1. Fujian University of Trational Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China; 2. Fujian Institute of
Trational Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350003，China; 3. Fujian Health College，F(xiàn)uzhou 350101，China

Abstract:Objective To study the apoptosis effect of LNcap Cells with the extract of Ampelopsis．Method Observing the apoptosis rates of LNcap cells by Annexin V/PI fluorescent staining of Flow Cytometric Method(FCM)．Result The apoptosis rates of LNcap cells rose significantly after 24 hours，with dose－response relationship．Conclusion The extract of Ampelopsis can induse apoptosis of LNcap Cells remarkably．

Key words:Ampelopsis; prostatic cancer; LNcap; Apoptosis

藤茶為葡萄科顯齒蛇葡萄Ampelopsis grossedentala(Hand－Mazz)W. T. Wang的莖葉，俗稱甘露茶、白毛猴、甜茶等，在我國廣西、湖南、福建等南方地區(qū)都有豐富的資源.其性涼，味甘淡，具有清熱解毒的功效，民間常用于咽喉腫痛、感冒發(fā)熱等[1].藤茶提取物中黃酮類部位平均含量超過15%，富含蛇葡萄素(3，5，7，3'，4，5'－六羥基－2，3雙氫黃酮醇，AMP)等物質，是主要活性部位[2].我們前期研究發(fā)現(xiàn)藤茶提取物對多種人癌細胞有抑制作用[3－5]，在此基礎上，本文主要以流式Annexin V/PI雙染法觀察其對人前列腺癌LNcap細胞的凋亡作用.

1　材料和儀器

1. 1藥物藤茶提取物為本實驗室自制[6].

1. 2細胞株人前列腺癌LNcap細胞，中國科學院上海細胞庫.

1. 3試劑1640培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(美國Hyclone公司);胰酶(美國Gibco公司); Annexin V/PI雙染試劑盒(美國BD公司).

1. 4儀器HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱(美國熱電公司);

BCM－1000超凈工作臺(蘇州凈化設備公司); FACSCali

bur流式細胞儀(美國BD公司); TS－100倒置顯微鏡(日本尼康公司).

圖1　實驗組和對照組LNcap細胞形態(tài)比較（24h）

2　方法

2. 1細胞培養(yǎng)將LNcap細胞置于含10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗.

2. 2細胞凋亡率測定取對數(shù)期生長的LNcap細胞接種于培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)箱過夜;實驗組加入適當濃度的藤茶提取物，使終濃度在25、50μg/ml，對照組加入同體積PBS; 24h后鏡下觀察細胞形態(tài);分別用胰酶消化各組細胞，PBS清洗，1500rpm離心5min，收集細胞;用PBS稀釋細胞至濃度1×106/ml，于暗處加入Annexin V、PI各5μl，振蕩混勻，室溫避光15min，上流式細胞儀檢測.

2. 3統(tǒng)計學處理采用SPSS18. 0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用(x± s)表示，組間的比較用單因素方差分析，P＜0. 05為差異具有統(tǒng)計學意義.

3　實驗結果

3. 1細胞形態(tài)學觀察正常LNcap細胞貼壁生長良好，排列緊密，有透光性.加入藤茶提取物處理后細胞數(shù)量明顯減少，部分細胞皺縮變圓，部分細胞懸浮甚至死亡.

3. 2細胞凋亡率如圖2，橫坐標代表Annexin V－FITC的熒光強度，縱坐標代表PI熒光強度，均采用對數(shù)坐標軸.左下象限為正常細胞，右上象限為壞死細胞，右下象限為凋亡細胞.經(jīng)藤茶提取物處理24h后，凋亡細胞明顯比對照組多，且有量效依賴關系(表1).壞死細胞結果類似凋亡細胞./%

圖2　流式細胞儀檢測細胞凋亡結果

表1　不同劑量藤茶提取物對LNcap細胞的凋亡作用(x±s，%)

4　討論

據(jù)文獻報道，藤茶提取物對多種人癌細胞都有很好的抑制作用.但除本課題組外，鮮有見到關于抗前列腺癌的報道[3－4，7].我們前期研究發(fā)現(xiàn)藤茶提取物在較低濃度下即對LNcap細胞有明顯的增殖抑制作用，并推測凋亡誘導可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的一個途徑.

流式Annexin V/PI雙染法是較為靈敏的細胞凋亡測定方法，通過Annexin V－FITC和PI雙重熒光標記以區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞和壞死細胞.生長旺盛的LNcap細胞經(jīng)過消化、洗滌、離心等操作也有一定比例的細胞凋亡和壞死，但發(fā)生率較低.在加入藤茶提取物處理24h即發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的凋亡率顯著上升，且呈量效依賴關系.提示藤茶提取物可能激活腫瘤細胞的信號通路，誘導腫瘤細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用.

參考文獻

[1]中國科學院植物所．中國高等植物圖譜補編第2冊[M]．北京:科學出版社，1983: 242．

[2]陳曉明，倪峰．藤茶藥理作用研究進展[J]．海峽藥學，2010，22(1): 16－17．

[3]周春權，姚欣，陳曉明，等．藤茶提取物的抗腫瘤作用研究[J]．中藥新藥與臨床藥理，2011，22(6): 640－642．

[4]倪峰，姚欣，郭丹，等．蛇葡萄素對人前列腺癌PC3細胞增殖與凋亡的影響[J]．中藥藥理與臨床，2012，28(3): 39－41．

[5]倪峰，周金榮．蛇葡萄素及富含蛇葡萄素的總黃酮有效部位在制備防治前列腺癌藥物中的應用:中國，ZL200810071687. 2[P]．公告日期．

[6]周春權，倪峰，林靜瑜，等．藤茶提取物的超聲提取及含量測定[J]．中華中醫(yī)藥學刊，2011，21(3): 2312－2314．

[7]姚欣，倪峰，郭丹，等．蛇葡萄素對人乳腺癌MCF－7細胞增殖與凋亡的影響[J]．福建中醫(yī)藥大學學報，2014(1): 22－23．

收稿日期:( 2015. 01. 15)

作者簡介:姚欣，男，助理研究員，主要從事中藥學研究.

基金項目:福建衛(wèi)生教育聯(lián)合攻關項目(WKJ－FJ－06)，福建省衛(wèi)計委科研項目(WZZE201302).

【文章編號】1007－8517(2015)05－0026－02

【文獻標志碼】A

【中圖分類號】R285. 5