孫玉鳳　羅亞非　范瑞娟貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州　貴陽　550002

桃紅四物湯對雄性SD大鼠腦缺血再灌注損傷海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的作用研究

孫玉鳳羅亞非*范瑞娟
貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002

【摘要】目的:探討桃紅四物湯對雄性SD大鼠腦缺血再灌注損傷海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的作用。方法:采用改良后的新式線栓法建模，隨機分為大腦中動脈阻塞再灌注組、正常組、桃紅四物湯低、中、高劑量治療組，每組各20只。治療組連續(xù)7d灌胃治療，每日兩次，早、晚各一次;模型組和正常組正常喂養(yǎng)。自第8天，對各實驗組大鼠進行神經(jīng)功能評分并處死取腦，用Nissl染色法觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量。結(jié)果:與模型組比較，桃紅四物湯治療組的神經(jīng)功能評分明顯增加(P＜0.01); Nissl染色治療組顯示海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，隨給藥劑量增加而增加(P＜0.01)。結(jié)論:腦缺血再灌注后，給予桃紅四物湯能顯著改善損傷大鼠的大腦神經(jīng)功能，增加海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量，并且其治療效果隨桃紅四物湯給藥劑量的增加而增強。

【關(guān)鍵詞】腦缺血再灌注;桃紅四物湯; SD大鼠;海馬CA1區(qū)

腦缺血再灌注一方面可挽救瀕臨死亡的細(xì)胞，另一方面又加重細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如何通過藥物降低腦缺血再灌注損傷，減少缺血細(xì)胞的死亡已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點。桃紅四物湯又名加味四物湯，出自于《醫(yī)壘元戎》，該方由四物湯加桃仁及紅花組成。方以熟地黃為君藥，既可以滋養(yǎng)陰血，又可以補腎填進;當(dāng)歸作為臣藥，養(yǎng)血又活血;白芍益陰養(yǎng)血;川芎活血行氣;桃仁、紅花活血祛瘀。全方以活血為主，兼養(yǎng)血，共奏養(yǎng)血活血之功效?，F(xiàn)代研究顯示桃紅四物湯有改善微循環(huán)[1]、抗血栓[2]、抗炎及提高免疫力[3]、抑制細(xì)胞凋亡[4]等作用。該方治療缺血性腦血管疾病所引起的腦缺血再灌注損傷的作用機制尚不十分清楚。本實驗通過神經(jīng)功能評分及Nissl染色，研究桃紅四物湯對大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的治療作用。

1　實驗材料

1.1實驗動物雄性SD大鼠，體重250g～300g(由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供)。

1.2材料桃仁5g，紅花2.5g，熟地黃5g，白芍5g，當(dāng)歸5g，川芎2.5g，均購自北京同仁堂貴陽分店。先加蒸餾水煮沸，合并2次藥液，按原方比例濃縮成生藥濃度分別為低(0.7g/kg)、中(1.4g/kg)、高(2.1g/kg)三種不同劑量[5]的桃紅四物湯水煎液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑及試劑盒4%水合氯醛: 40g水合氯醛粉末，29g磷酸氫二鈉，2.965g磷酸二氫鈉，1000ml蒸餾水(于60℃水浴鍋中加熱充分溶解冷卻后，4℃保存); Nissl染色液，焦油堅牢紫1g，蒸餾水100ml; 0.1% TritonX－100通透液配制方法: 0.1g檸檬酸鈉，100ml蒸餾水; 0.1TritonX －100(pH7.0)，蒸餾水加至1000ml，37℃水浴中3h，充分溶解混勻;其他如中性樹膠、酒精、二甲苯等均為市售國產(chǎn)分析純。

1.4儀器手術(shù)顯微鏡(日本Sanyo公司);大鼠腦切片模具(上海玉研科學(xué)儀器有限公司); BS－110S電子天平(北京德賽公司); KH－BM型石蠟自動包埋機(浙江科迪有限公司);病理切片機(德國LEICA公司); MLTRA GE MK2型超純水系統(tǒng)(英國ELGA公司);電熱恒溫干燥箱(上海博迅公司);光學(xué)顯微鏡(日本Sanyo公司)。

2　方法與結(jié)果

2.1實驗方法

2.1.1實驗動物分組及給藥方法將100只雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組(大腦中動脈阻塞再灌注組)、桃紅四物湯低(0.7g/kg)、中(1.4g/kg)、高(2.1g/kg)劑量組共5組，每組各20只。桃紅四物湯低、中、高劑量組分別以桃紅四物湯低、中、高劑量灌胃，每日早晚各一次。模型組不進行任何治療，正常組正常飼養(yǎng)。至第8天時，將各組大鼠處死并取腦，取下的腦組織用于制作病理切片。

2.1.2大鼠線栓法局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)制作實驗前對大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，自由飲水進食。術(shù)前12h禁食，自由飲水。3%水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位，將大鼠四肢固定，頸前區(qū)備皮，常規(guī)消毒。頸正中線切口3～4cm，鈍性分離兩側(cè)甲狀腺，暴露右側(cè)的胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的三角區(qū)域;沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離肌肉筋膜，暴露頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA);在CCA的近心端和遠(yuǎn)心端分別穿線備用，兩線相隔約1～2cm左右;近心端系緊，約距此節(jié)1cm處的遠(yuǎn)心端為松節(jié)備用;在CCA近分叉處以微動脈夾暫時夾閉;在CCA的兩線間，距CCA分叉處5mm左右，剪一斜行45°小口;待直徑約0.23mm的栓線插入CCA后，取下微動脈夾;將栓線沿CCA插入ICA，最后送入大腦中動脈(MCA)，在標(biāo)記接近CCA分叉處或著遇阻力感時停止(插入距離一般為(18.5±0.5)mm的深度)，在缺血90min后緩慢抽出栓線，將CCA上遠(yuǎn)心端的松結(jié)系緊，并縫合。

2.1.3神經(jīng)功能評分參照Garcia JH神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)[6]，于術(shù)后24h、第8天對實驗大鼠評分并記錄，以評價大鼠的神經(jīng)行為學(xué)。包括以下6項:自主運動、四肢運動的對稱性、前爪的伸展性、攀爬運動、肢體的本體感覺、觸須反應(yīng)。

2.1.4Nissl染色對制作好的石蠟切片，二甲苯脫蠟10min，放入100%乙醇洗5min，90%乙醇5min，70%乙醇5min，蒸餾水2min。處理好的樣品放入尼氏染色液中染色10min，蒸餾水洗2次，90%乙醇洗5s，70%乙醇洗5s，經(jīng)95%乙醇脫水2min后，再換新鮮95%乙醇脫水2min，二甲苯透明5min，換用新二甲苯再透明5min，最后，以中性樹膠封片。

2.1.5圖像分析使用光學(xué)顯微鏡在400倍鏡下隨機選取5個視野，記錄5個視野中正常神經(jīng)元的總和，觀測各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量。Nissl染色以細(xì)胞漿和細(xì)胞核呈深藍色，細(xì)胞形態(tài)完整者為正常神經(jīng)細(xì)胞。

2.1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0進行數(shù)據(jù)處理，連續(xù)變量用(±s)表示，檢驗方法為單因素方差分析，所有分析都采用雙側(cè)檢驗法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2實驗結(jié)果

2.2.1一般情況正常組大鼠的精神狀態(tài)良好，活動靈活，毛發(fā)白而有光澤，皮膚粘膜紅潤，飲食量、飲水量均正常，體重呈穩(wěn)步上升趨勢。模型組與桃紅四物湯各劑量組大鼠術(shù)后與術(shù)前相比均出現(xiàn)神差、毛發(fā)暗淡無光澤、飲食飲水減少、體重減輕、活動障礙等現(xiàn)象?；顒诱系K主要表現(xiàn)為同側(cè)的Horner征陽性、眼裂變小、眼球內(nèi)陷、瞳孔縮小，且伴有非手術(shù)側(cè)肌張力的下降、軀體向非手術(shù)側(cè)傾斜屈曲甚至扭轉(zhuǎn)、尾部彎向非手術(shù)側(cè)、提尾懸空時呈強迫性體態(tài)。在術(shù)后的7d時間里，模型組的整體狀態(tài)變化并不明顯，而桃紅四物湯各劑量組大鼠一般情況及活動障礙表現(xiàn)與模型組相比均有所改善。其中低劑量組大鼠精神狀態(tài)及飲食飲水等一般情況均有所恢復(fù)，活動障礙略微減輕;中劑量組飲食、飲水恢復(fù)良好，體重有所上升，活動障礙一定程度減輕;高劑量組大鼠飲食飲水恢復(fù)正常，體重回升，活動障礙明顯減輕?？梢婋S給藥劑量的增加，大鼠一般情況的改善情況也愈加明顯。

2.2.2神經(jīng)功能評分各組大鼠在處死前均進行神經(jīng)功能評分，正常組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，神經(jīng)功能評分為18分。模型組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，神經(jīng)功能評分較正常組明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，桃紅四物湯低、中、高劑量組均能顯著改善大鼠神經(jīng)功能缺損的癥狀，增加大鼠的神經(jīng)功能評分(P＜0.01)。經(jīng)桃紅四物湯治療后，高劑量組大鼠的神經(jīng)功能評分明顯高于中劑量組及低劑量組(P＜0.01);中劑量組大鼠的神經(jīng)功能評分高于低劑量組(P =0.002＜0.01)。見表1。

表1　桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)功評分的影響(±s)

表1　桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)功評分的影響(±s)

注:●例數(shù)為各組除去死亡動物之后實際檢測數(shù)(動物死亡原因主要包括:手術(shù)操作意外或灌胃死亡);與正常組比較，△P＜0.01;與模型組比較，▲P＜0.01;與桃紅四物湯中高劑量組比較，cP＜0.01;與桃紅四物湯低劑量組比較，bP＜0.01。

組別　劑量(g/kg)例數(shù)●(只)神經(jīng)功能評分(分)正常組?。?0　18模型組?。?1　8.09±0.94△桃紅四物湯低劑量組　0.7　14　11.79±0.97▲桃紅四物湯中劑量組　1.4　15　12.60±0.74▲b桃紅四物湯高劑量組　2.1　16　13.50±0.89▲c

2.2.3Nissl染色統(tǒng)計分析顯示，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺血再灌注區(qū)域正常存活神經(jīng)元的個數(shù)較正常組顯著減少(P＜0.01);桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺血再灌注區(qū)正常存活神經(jīng)元個數(shù)較模型組均明顯增多(P＜0.01);桃紅四物湯各劑量組中，高劑量組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺血再灌注區(qū)域正常存活神經(jīng)元多于中劑量組(P =0.011＜0.05)及低劑量組(P＜0.01)，中劑量組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺血再灌注區(qū)正常存活神經(jīng)元又多于低劑量組(P＜0.01)。見表2、圖1。

表2　桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠存活神經(jīng)元的影響(±s)

表2　桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠存活神經(jīng)元的影響(±s)

注:●例數(shù)為各組除去死亡動物之后實際檢測數(shù)(動物死亡原因主要包括:手術(shù)操作意外或灌胃死亡);與正常組比較，△P＜0.01;與模型組比較，▲P＜0.01;與桃紅四物湯中劑量組比較，cP ＜0.05;與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.01;與桃紅四物湯低劑量組比較，bP＜0.01。

組別　劑量(g/kg)例數(shù)●(只)存活神經(jīng)元個數(shù)正常組?。?0　62±3.73模型組?。?　3±1.36△桃紅四物湯低劑量組　0.7　7　32±2.94▲桃紅四物湯中劑量組　1.4　8　39±2.88▲b桃紅四物湯高劑量組　2.1　8　41±3.87▲c

圖1　大鼠腦組織冠狀切片，大腦皮質(zhì)區(qū)，Nissl染色(400倍)

3　討論

研究表明，腦缺血損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡中，凋亡是重要的神經(jīng)細(xì)胞死亡方式[7]，且多發(fā)生在缺血再灌注24h之后，是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(delayed neuron death，DND)的主要參數(shù)與形式。據(jù)文獻報道[8]，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對腦缺血缺氧最為敏感，腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡在缺血后72h達到高峰，并且持續(xù)存在可長達數(shù)周[9]。桃紅四物湯各劑量組均能改善腦缺血再灌注模型大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，降低其腦梗死體積率，減輕其大腦皮質(zhì)缺血區(qū)域的病理損傷。隨給藥劑量的增加，桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠損傷的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的治療作用也得到了加強。

近年來，中藥在救治腦血管病的機制研究中取得很大突破，許多研究證實，中藥對改善腦缺血性細(xì)胞損傷有獨特優(yōu)勢[10]。本實驗結(jié)果表明，桃紅四物湯在防治腦缺血再灌注損傷方面，從低劑量開始起效，并且治療作用隨劑量的加大而呈增加的趨勢，通過減少大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，對大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元起到治療作用。但這些實驗結(jié)果只是初步的探索，對腦缺血再灌注損傷治療作用的具體機制仍需進一步研究探討。

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收稿日期:( 2014.10.31)

通信作者:羅亞非(1965－)，男，教授，主要從事中藥對腦血管疾病形態(tài)學(xué)影響的研究。E－mail: 944943527@ qq.com

作者簡介:孫玉鳳(1986－)，女，貴陽中醫(yī)學(xué)院2012級中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)理論專業(yè)研究生。

基金項目:貴州省科技廳聯(lián)合基金項目(黔科合中藥字[2011]LKZ7034號)。

【文章編號】1007－8517(2015)03－0009－03

【文獻標(biāo)志碼】A

【中圖分類號】R285.5