黃澤炳，黃　燕，周蓉蓉，陳若蟬，易盼盼，李　寧，范學(xué)工

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙　410008)

?

HMGB1抗體對刀豆蛋白A引起小鼠肝損傷的保護作用

黃澤炳，黃燕，周蓉蓉，陳若蟬，易盼盼，李寧，范學(xué)工

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙410008)

[摘要]目的研究高遷移率族蛋白1(HMGB1)抗體對刀豆蛋白A(ConA)引起小鼠肝損傷的保護作用。方法將健康無污染雄性Balb/c小鼠分成空白對照組(注射生理鹽水)、模型組(注射ConA)和實驗組(注射ConA+HMGB1抗體)，3組小鼠注射藥物6 h后摘眼球取血,所獲血液離心后取血清檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和HMGB1，留取肝臟組織進行HE染色、Tunel、免疫熒光等檢測。結(jié)果實驗組小鼠肝組織病理炎癥反應(yīng)輕于模型組。小鼠血清中ALT、HMGB1：空白對照組分別為(52.00±8.34)U/L、(7.54±0.53)ng/mL，模型組分別為(5 551.50±1 445.74)U/L、(18.06±1.65)ng/mL，實驗組分別為(1 977.40±654.89)U/L、(10.77±0.71)ng/mL；肝組織中HMGB1 mRNA、HMGB1表達量(相對值)：空白對照組分別為1.886±0.253、0.086±0.028，模型組分別為4.718±0.341、0.268±0.043，實驗組分別為3.005±0.331、0.116±0.008；實驗組小鼠血清中ALT、HMGB1，以及肝組織中HMGB1 mRNA、HMGB1表達量均低于模型組(均P<0.001)。肝組織細胞凋亡、肝細胞內(nèi)HMGB1遷移(標(biāo)準化)：空白對照組均為1±0，模型組分別為4.67±0.33、4.50±0.22，實驗組分別為2.67±0.21、2.33±0.21；實驗組小鼠肝組織細胞凋亡、肝細胞內(nèi)HMGB1遷移均低于模型組(均P<0.001)。結(jié)論HMGB1抗體能改善肝組織的病理損傷，可以保護ConA引起的小鼠肝損傷。

[關(guān)鍵詞]HMGB1抗體； 高遷移率族蛋白1； 刀豆蛋白A； 肝損傷； 保護作用； 肝損傷模型； 急性肝損傷； 模型小鼠

[Chin Infect Control，2015，14(12)：793-797]

肝損傷是一種臨床常見情況，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，并發(fā)癥多，甚至病情危急，不及時處理會發(fā)展為肝衰竭而死亡。乙型肝炎病毒(HBV)感染是我國急性肝損傷最常見的病因，一般認為肝損傷是由HBV感染引起的宿主免疫反應(yīng)所導(dǎo)致[1]。在HBV感染導(dǎo)致的肝損傷過程中，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)特異性CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)在肝損傷過程中起關(guān)鍵作用[2]，其他非特異性免疫細胞如巨噬細胞、NK細胞等也發(fā)揮了重要作用[3]。此外，由活化的免疫細胞所分泌的細胞因子如IFN-γ、TNF-α等也參與了肝細胞損傷作用[4-5]。目前仍缺乏有效的治療肝損傷的醫(yī)療手段。高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是一類在真核細胞中含量豐富的非組蛋白核蛋白[6]。近年研究[7]表明,細胞核內(nèi)HMGB1轉(zhuǎn)移至胞外后，演變成一種炎癥介質(zhì)。HMGB1既可以作為炎癥細胞因子參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，又能與多種促炎介質(zhì)相互誘導(dǎo)表達，還能引起炎癥信號分子NF-kB核移位，形成一個復(fù)雜的細胞因子分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，啟動、維持和放大炎癥反應(yīng)[8-9]。因此，HMGB1在致炎細胞因子網(wǎng)絡(luò)中可能是一個關(guān)鍵中心環(huán)節(jié)[10]。紐約大學(xué)Wang等[11-12]認為，HMGB1抗體可以用來治療敗血癥。本課題在前期工作的基礎(chǔ)上使用刀豆蛋白A(ConA)建立小鼠肝損傷模型，觀察HMGB1抗體對小鼠肝損傷的保護作用。

1材料與方法

1.1動物雄性Balb/c小鼠(SPE級)，6周齡，體重約20 g，由中南大學(xué)動物學(xué)部提供。動物實驗得到中南大學(xué)動物學(xué)部實驗動物管理與使用認證協(xié)會(IA CU C) 批準。

1.2試劑ConA、Elisa試劑盒等購自于Sigma公司。HMGB1抗體由美國紐約大學(xué)王海潮(Haichao Wang)提供[11-12]。

1.3動物模型將健康無污染雄性Balb/c小鼠分成3組：空白對照組、模型組和實驗組。模型組、實驗組小鼠尾靜脈注射ConA 20 mg/kg(ConA溶于無熱源的生理鹽水，濃度為2 mg/mL)，空白對照組的小鼠尾靜脈注射生理鹽水(200 μL/20 g。1 h后，空白對照組、模型組小鼠腹腔注射生理鹽水200 μL /20 g，實驗組小鼠腹腔注射anti-HMGB1 100 μg/20 g(anti-HMGB1溶于生理鹽水，濃度為0.5 mg/mL)。6 h后摘小鼠眼球取血，頸椎脫臼處死后取肝臟。血液離心后獲的血清及所取肝組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4方法

1.4.1HE染色采用HE染色檢測小鼠肝組織病理變化。石蠟切片5 μm脫蠟后蘇木素染色3 min，自來水沖洗后0.5%鹽酸乙醇分化30 s，自來水沖洗后伊紅染色1 min，切片水洗后快速通過梯度乙醇脫水，晾干后封片備用。

1.4.2Tunel使用Tunel方法觀察肝組織的細胞凋亡。石蠟切片在二甲苯中脫蠟2次，每次5～10 min。乙醇水合(100%、95%、90%、80%、75%)每組2 min；PBS漂洗2次，滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，20～37℃作用 20 min，PBS洗滌3次。室溫在封閉液(3%雙氧水溶于甲醇)中封閉10 min，PBS漂洗3次，根據(jù)試劑盒制備Tunel反應(yīng)混合液，每個樣本加反應(yīng)液50 μL，加蓋玻片37℃恒溫避光濕潤反應(yīng)60 min，熒光顯微鏡下檢測觀察(其中陰性對照組中反應(yīng)液不加TdT酶)。

1.4.3免疫熒光采用免疫熒光法檢測肝細胞內(nèi)HMGB1的遷移。取石蠟切片，二甲苯中脫蠟2次，每次5～10 min。乙醇水合(100%、95%、90%、80%、75%)每組2 min；PBS沖洗3次，1%的Triton破膜20 min，羊血清封閉30 min，加第一抗體(1∶200)后孵育12 h，陰性對照用熒光二抗代替第一抗體；第二抗體室溫(避光)孵育2 h，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，照相，圖像軟件分析平均灰度值。

1.4.4血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和HMGB1檢測使用速率法檢測ALT,ELISA檢測血清中HMGB1。

1.4.5Western blot應(yīng)用Western blot檢測肝組織HMGB1表達量。提取組織總蛋白，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉2 h，加1∶500一抗(HMGB1)4℃孵育過夜，1∶2 000二抗室溫孵育2 h，TBST洗凈3次后加ECL發(fā)光液，觀察結(jié)果。

1.4.6實時定量熒光PCR(real time PCR)檢測按照說明書步驟，采用TRIZOL(Invitrogen公司)法提取RNA，取1 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA:HMGB1上下游引物分別為5’- CTGCCTACAGAGCTAAAGGA-3’，5’- CTGCGCTAGAACCAACTTAT-3’；β-actin引物分別為5’- GGCATCCATGAAACTACATT-3’、5’- GATCTTCATGGTGCTAGGAG-3’。 反應(yīng)體系:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL,上下游引物各2 μL, 2×SYBR Green PCR Master mix 12.5 μL,ddH2O補充至25 μL。PCR反應(yīng)條件95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s， 95℃ 15 s， 60℃ 1 min，40個循環(huán)結(jié)束。

2結(jié)果

2.1小鼠肝組織病理變化HE染色結(jié)果顯示:空白對照組小鼠病理切片未見肝細胞壞死與炎癥細胞浸潤；模型組小鼠見肝細胞變性、壞死，炎癥細胞浸潤；實驗組未見明顯的肝細胞壞死，但匯管區(qū)見炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 　小鼠肝組織病理變化(HE染色，n=6)

2.2小鼠肝組織細胞凋亡情況標(biāo)準化細胞凋亡程度：空白對照組為1±0，模型組為4.67±0.33，實驗組為2.67±0.21，各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65,P<0.001)；各組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，實驗組肝組織細胞凋亡程度輕于模型組。

2.3肝細胞內(nèi)HMGB1遷移情況胞核轉(zhuǎn)移至胞漿的HMGB1(標(biāo)準化遷移程度)：空白對照組為1±0，模型組為4.50±0.22，實驗組為2.33±0.21。各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=99.12,P<0.001);兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),實驗組HMGB1遷移量較模型組少。見圖2。

圖2 　肝細胞中HMGB1遷移情況(n=6)

2.4小鼠血清中ALT和HMGB1表達量空白對照組小鼠血清中ALT為(52.00±8.34)U/L，模型組為(5 551.50±1 445.74)U/L，實驗組為(1 977.40±654.89)U/L。各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.27,P=0.002)；兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，實驗組小鼠血清中ALT低于模型組。見圖3。小鼠血清中HMGB1:空白對照組為(7.54±0.53)ng/mL，模型組為(18.06±1.65)ng/mL，實驗組為(10.77±0.71)ng/mL，各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.76,P<0.001);兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，實驗組小鼠血清中HMGB1低于模型組。

圖3 　血清ALT的變化(n=6)

2.5小鼠肝組織HMGB1 mRNA和HMGB1表達量肝組織HMGB1 mRNA相對表達量：空白對照組為1.886±0.253，模型組為4.718±0.341，實驗組為3.005±0.331；各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.03,P<0.001)；兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，實驗組小鼠肝組織HMGB1 mRNA低于模型組。見圖4。小鼠肝組織中HMGB1表達量(單位：相對灰度值)：空白對照組為0.086±0.028，模型組為0.268±0.043，實驗組為0.116±0.080，各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.45,P=0.001)；兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),實驗組小鼠肝組織中HMGB1表達量低于模型組。見圖5。

圖4 　小鼠肝組織HMGB1 mRNA表達(n=6)

Figure 4Expression of HMGB1 mRNA in mice liver tissue (n=6)

圖5 　肝組織中HMGB1的表達(n=6)

Figure 5Expression of HMGB1 in mice liver tissue (n=6)

3討論

我國病毒性肝炎尤其是乙型肝炎所致的肝損傷患者數(shù)量居全球首位，由于缺乏有效的特異性治療手段, 肝損傷常發(fā)展為病死率極高的肝衰竭。肝損傷或肝衰竭的主要機制是宿主炎癥反應(yīng)，由于肝炎病毒感染宿主的特異性，當(dāng)前缺乏理想的乙肝病毒所引起的肝損傷動物模型。學(xué)界認為，ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷的免疫發(fā)病機制被認為與乙型肝炎病毒所致肝損傷相類似，是可替代后者的理想動物模型[2,13-14]。通過尾靜脈注射ConA至鼠體內(nèi)后，可刺激T細胞產(chǎn)生IL-6、IFN-γ、TNF-α[13]。研究[4-5]認為，IFN-γ能激活包括NK細胞在內(nèi)的免疫細胞定植或聚集在肝臟，引起炎癥和損害，而TNF-α具有肝細胞毒性作用。

HMGB1是一種炎癥因子，能夠介導(dǎo)其他炎癥因子引起炎癥瀑布。研究證實，HMGB1在炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[7]；HMGB1在炎癥發(fā)生后的數(shù)小時開始大量分泌[15]，因此我們認為較早中和HMGB1可能很大程度上減弱炎癥反應(yīng)。本組實驗結(jié)果表明，HMGB1抗體處理后的小鼠肝組織中HMGB1相對含量、mRNA相對量，以及血清中HMGB1含量、ALT值均低于模型組(ConA處理)。HMGB1抗體處理后小鼠肝組織HE染色見炎癥細胞浸潤，但未見壞死，肝細胞凋亡輕微。而未加HMGB1抗體處理的小鼠肝組織HE染色顯示，肝組織大片壞死、炎癥細胞浸潤，且細胞凋亡明顯。說明特異性HMGB1抗體能夠通過中和降低肝組織中及體內(nèi)HMGB1，保護肝臟避免受到損傷。實驗組小鼠注射ConA 1 h后即注射HMGB1抗體，目的是為較早中和炎癥狀態(tài)下釋放出的HMGB1，盡可能減少HMGB1引起的炎癥損傷，以及炎癥瀑布，結(jié)果顯示，注射HMGB1抗體6 h后能有效阻止肝損傷。

肝損傷危害較大，盡早控制肝損傷對于患者的預(yù)后有很大幫助。本實驗在其他研究者的研究基礎(chǔ)之上，證實使用HMGB1抗體早期干預(yù)可以有效減輕肝臟的損害程度，說明HMGB1能成為有效防治肝損傷的重要靶點，為進一步研究防治肝損傷提供重要的實驗依據(jù)。

[參 考 文 獻]

[1]Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis[J]. Annu Rev Immunol, 1995,13: 29-60.

[2]Nakamoto Y, Kaneko S. Mechanisms of viral hepatitis induced liver injury [J]. Curr Mol Med, 2003,3(6): 537-544.

[3]Zheng Q, Zhu YY, Chen J,et al.Activated natural killer cells accelerate liver damage in patients with chronic hepatitis B virus infection[J]. Clin Exp Immunol, 2015,180(3): 499-508.

[4]Horras CJ, Lamb CL,and Mitchell KA. Regulation of hepatocyte fate by interferon-γ [J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2011,22(1): 35-43.

[5]Leist M, Gantner F, Bohlinger I, et al. Murine hepatocyte apoptosis induced in vitro and in vivo by TNF-alpha requires transcriptional arrest[J]. J Immunol, 1994,153(4): 1778-1788.

[6]Thomas JO, Travers AA.HMG1 and 2, and related ‘a(chǎn)rchitectural’ DNA-binding proteins[J]. Trends Biochem Sci, 2001,26(3): 167-174.

[7]Wang H, Bloom O, Zhang M, et al.HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J]. Science, 1999, 285(5425): 248-251.

[8]Fiuza C, Bustin M, Talwar S,et al. Inflammation-promoting activity of HMGB1 on human microvascular endothelial cells[J]. Blood, 2003,101(7): 2652-2660.

[9]Park JS, Svetkauskaite D, He Q, et al. Involvement of toll-like receptors 2 and 4 in cellular activation by high mobility group box 1 protein[J]. J Biol Chem, 2004,279(9): 7370-7377.

[10] Erlandsson Harris H, Andersson U. Mini-review: The nuclear protein HMGB1 as a proinflammatory mediator[J]. Eur J Immunol, 2004, 34(6): 1503-1512.

[11] Wang H, Zhu S, Zhou R,et al.Therapeutic potential of HMGB1-targeting agents in sepsis[J]. Expert Rev Mol Med, 2008,10: e32.

[12] Wang H, Ward MF, Sama AE. Targeting HMGB1 in the treatment of sepsis[J]. Expert Opin Ther Targets, 2014,18(3): 257-268.

[13] Cao Q, Batey R, Pang G, et al.IL-6, IFN-gamma and TNF-alpha production by liver-associated T cells and acute liver injury in rats administered concanavalin A[J]. Immunol Cell Biol, 1998,76(6): 542-549.

[14] Li N, Liu YH, Li SL, et al.Protective role of synthetic oligodeoxynucleotides expressing immunosuppressive TTAGGG motifs in concanavalin A-induced hepatitis[J]. Immunol Lett, 2013,151(1-2): 54-60.

[15] 劉洪波，范學(xué)工，劉悅暉，等.肝損傷模型小鼠高遷移率族蛋白-1的表達[J].生命科學(xué)研究, 2008,12(2): 168-173.

(本文編輯：左雙燕)

·論著·

Protective role of high mobility group box-1 protein antibody in ConA-induced liver injury in mice

HUANGZe-bing,HUANGYan,ZHOURong-rong,CHENRuo-chan,YIPan-pan,LINing,FANXue-gong(XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the protective role of high mobility group box-1 protein (HMGB1) antibody in concanavalin A(ConA)-induced liver injury in mice.MethodsThe healthy male Balb/c mice were grouped into control group (saline injection), model group(ConA injection) and experimental group(ConA+HMGB1 antibody injection). After 6 hours of injection, mice blood was collected for detecting alanine transaminase (ALT) and HMGB1,liver tissue was used to do HE stain, Tunel, and immunofluorescence detection.ResultsPathological inflammation in experimental group was slighter than model group. The levels of ALT and HMGB1 in mice serum were (52.00±8.34)U/L and (7.54±0.53)ng/mL in control group，(5 551.50±1 445.74)U/L and (18.06±1.65)ng/mL in model group，(1 977.40±654.89)U/L and (10.77±0.71)ng/mL in experimental group, respectively; the expression levels of HMGB1 mRNA and HMGB1 (relative value) in liver tissue were 1.886±0.253 and 0.086±0.028 in control group，4.718±0.341 and 0.268±0.043 in model group，3.005±0.331 and 0.116±0.008 in experimental group, respectively; the expression levels of ALT and HMGB1 in serum, as well as HMGB1 mRNA and HMGB1 in liver tissue of experimental group were all lower than model group(all P<0.001). Apoptosis and HMGB1 migration in the liver cell (normalized) were 1±0 and 1±0 in control group, 4.67±0.33 and 4.50±0.22 in model group，2.67±0.21 and 2.33±0.21 in experimental group, respectively; apoptosis and HMGB1 migration in liver tissue of experimental group were both lower than model group(both P<0.001).ConclusionHMGB1 antibody can improve the pathological injury of liver tissue, and protect mice liver against the injury induced by ConA.

[Key words]HMGB1 antibody; high mobility group box-1; concanavalin A; liver injury; protective role; liver injury model; acute liver injury; mouse model

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2015.12.002

[通信作者]王強E-mail：ttyywq@163.com

[作者簡介]康建磊(1988-)，男(漢族)，河南省鄭州市人，住院醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科顱內(nèi)感染診治研究。

[收稿日期]2015-02-28

[中圖分類號]R575

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-9638(2015)12-0793-05